薬剤耐性マラリアの出現を予測する：加速進化系による包括的実験室進化システムの開発

• Project/Area Number: 17H04074
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Research Field: Parasitology (including sanitary zoology)
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 美田 敏宏 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80318013)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 平井 誠 順天堂大学, 医学部, 准教授 (50326849)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥17,810,000 (Direct Cost: ¥13,700,000、Indirect Cost: ¥4,110,000); Fiscal Year 2019: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000); Fiscal Year 2018: ¥6,890,000 (Direct Cost: ¥5,300,000、Indirect Cost: ¥1,590,000); Fiscal Year 2017: ¥7,150,000 (Direct Cost: ¥5,500,000、Indirect Cost: ¥1,650,000)
• Keywords: マラリア / 薬剤耐性 / ミューテータ / 実験室進化 / 実験進化

Outline of Annual Research Achievements

薬剤耐性マラリア原虫の出現と拡散は大きなglobal issueである。しかし、現在の熱帯熱マラリア原虫における薬剤耐性研究は、すでに出現・拡散した薬剤耐性原虫の解析によるretrospectiveな知見が中心である。このため薬剤耐性遺伝子が同定されても、すでに流行地に出現さらには蔓延化しており、実際面でのインパクトは弱い。本研究では通常の50～100倍多く遺伝子変異を起こすミューテータ熱帯熱マラリア原虫を作成、それを用いた包括的加速系進化システムを開発する。ミューテータはDNA複製酵素の校正活性のみを低下させ、本来修復されるエラーをそのままゲノム内に取り込ませることで変異率の上昇を狙ったシステムである。
本システムによって、短期間で薬剤耐性原虫が単離され、迅速な耐性責任遺伝子の同定と耐性遺伝子マーカーの開発が可能になる。さらにラボ研究と併用してフィールでの実地研究を行い、加速系進化システムによって得られた候補耐性マーカーの有用性を集団ゲノム学的に検証する。
H30年度はラボ実験として、熱帯熱マラリア原虫ミューテータの作製とクローニングを終了した。安定した形質が発現しているかについて確認し、薬剤耐性原虫の単離を開始した。フィールドでは、ウガンダでのマラリア薬剤耐性包括調査を実施し、H29年度と同様にin vivoでアルテミシニンに耐性を示す原虫が存在することを確認した。これらの耐性原虫は凍結保存して順天堂大・熱帯医学寄生虫病学講座のラボに持ち帰り、耐性培養株の樹立を開始した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

予定では薬剤耐性原虫の単離実験をH30年8月から開始し、当該年度中に薬剤耐性原虫の単離を終了する予定であったが、安定した形質を持つミューテータ原虫の作成に時間がかかり、単離実験の開始が遅れたためH30年度内に耐性原虫の単離に至らなかった。このため、一部H31年度への繰越（翌債）を申請した。一方、本年度は実証実験としてのフィールド調査の進捗は順調であり、本研究課題に必要な検体が順次蓄積された。

Strategy for Future Research Activity

今後の研究の推進方策については変更はない。
フィールドでの耐性進化の歴史に倣い、まずクロロキンに対する耐性原虫の単離を進める。その後、アルテミシニン併用療法のパートナー薬として用いられているルメファントリン、ピペラキン、アモディアキン、メフロキンの薬剤圧下で培養し、それぞれの抗マラリア薬に対する耐性原虫を単離、つぎに、上記併用剤へ耐性化したミューテータ原虫を、さらにARTへ耐性化させていき、いまだ野生では出現してないアルテミシニン併用療法への完全耐性原虫を単離する。以上の計画と平行して、実集団においてどのようなゲノムの変化が起こっているのかを検討する。本結果とミューテータ原虫から得られたアルテミシニン耐性原虫ゲノムの比較により、すでに推定耐性変異は実際のフィールドで出現しはじめているのか、その変異は自然集団ではどれぐらいおこりやすいのかについて検証する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] グル大学(ウガンダ)
• [Int'l Joint Research] デバイン大学(パプアニューギニア)
• [Int'l Joint Research] オックスフォード大学(英国)
• [Int'l Joint Research] マヒドン大学(タイ)
• [Journal Article] Development of a highly sensitive, quantitative, and rapid detection system for Plasmodium falciparum-infected red blood cells using a fluorescent blue-ray optical system., (2019)
  • Author(s): Yamamoto Takeki、Yatsushiro Shouki、Hashimoto Muneaki、Kajimoto Kazuaki、Ido Yusuke、Abe Kaori、Sofue Yasuyuki、Nogami Takahiro、Hayashi Takuya、Nagatomi Kenji、Minakawa Noboru、Oka Hiroaki、Mita Toshihiro、Kataoka Masatoshi
  • Journal Title: Biosensors and Bioelectronics. Volume: 132 Pages: 375-381
  • DOI: 10.1016/j.bios.2019.02.064
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] See-through observation of malaria parasite behaviors in the mosquito vector. (2019)
  • Author(s): Mori Toshiyuki、Hirai Makoto、Mita Toshihiro
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 9 Pages: 1768-1768
  • DOI: 10.1038/s41598-019-38529-3
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Rapid selection of sulphadoxine-resistant Plasmodium falciparum and its effect on within-population genetic diversity in Papua New Guinea (2018)
  • Author(s): Mita T, Hombhanje F, Takahashi N, Sekihara M, Yamauchi M, Tsukahara T, Kaneko A, Endo H, Ohashi J. (Corresponding author)
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 8 Pages: 5565-5565
  • DOI: 10.1038/s41598-018-23811-7
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Lack of significant recovery of chloroquine sensitivity in Plasmodium falciparum parasites following discontinuance of chloroquine use in Papua New Guinea. (2018)
  • Author(s): Sekihara M, Tachibana S-I, Yamauchi M, Yatsushiro S, Tiwara S, Fukuda N, Ikeda M, Mori T, Hirai M, Hombhanje F, Mita T
  • Journal Title: Malar J. Volume: 17 Pages: 434-434
  • DOI: 10.1186/s12936-018-2585-x
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] 薬剤耐性マラリア原虫の進化 (2018)
  • Author(s): 美田敏宏
  • Journal Title: 生物の科学 遺伝 Volume: 72 Pages: 382-388
• [Journal Article] 薬剤耐性マラリアの最新疫学知見 (2018)
  • Author(s): 美田敏宏
  • Journal Title: 病原微生物検出情報 国立感染症研究所 Volume: 39 Pages: 173-174
• [Journal Article] 蚊媒介感染症に関する最近の話題 (2017)
  • Author(s): 美田敏宏
  • Journal Title: 臨床と微生物 Volume: 44 Pages: 263-268
• [Journal Article] Absence of in-vivo selection for K13 mutations after artemether-lumefantrine treatment in Uganda. (2017)
  • Author(s): Balikagala B, Mita T, Ikeda M, Sakurai M, Yatsushiro S, Takahashi N, Tachibana SI, Auma M, Ntege EH, Ito D, Takashima E, Palacpac NM, Egwang TG, Onen JO, Kataoka M, Kimura E, Horii T, Tsuboi T.
  • Journal Title: Malaria Journal Volume: 16(1) Pages: 1-23
  • DOI: 10.1186/s12936-016-1663-1
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] Altered gut microbiota composition in Plasmodium falciparum patients in Uganda (2018)
  • Author(s): Taniguchi T. Miyauchi E. Olia A. Nagayasu E. Osbert K. Suzue K. Imai T. Shimokawa C. Onishi R. Odongo-Aginya EI. Palacpac N. Maruyama H. Kimura E. Mita T. Ohno H. Horii T.andHisaeda H.
  • Organizer: 14th International congress of parastiology
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Global issue of drug resistant malaria and population structure of malaria parasites for global malaria control (2018)
  • Author(s): Mita T. Tachibana S. Sekihara M. Yamauchi M. Hombhanje F.andOhashi J
  • Organizer: 14th International congress of parastiology
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Detection of Artemisinin-resistant Plasmodium falciparum with High Survival Rates in Uganda (2018)
  • Author(s): Mita T. Ikeda M. Kaneko M. Tachibana S. Balikagala B. Sakurai-Yatsushiro M. Yatsushiro S. Takahashi N. Yamauchi M. Sekihara M. Hashimoto M. Obwoya PS. Auma MA. Anywar DA. Odongo-Aginya EI. Hirai M. Ohashi J. Palacpac NMQ. Kataoka M. Tsuboi T. Kimura E.andHorii T
  • Organizer: 14th International congress of parastiology
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 原虫学・寄生虫学が現代のトップサイエンスにもたらす貢献 マラリアミューテーター マラリア原虫薬剤耐性進化解明の新たな研究ツール. (2017)
  • Author(s): 平井誠, 池田美恵, 橘真一郎, 美田敏宏.
  • Organizer: 生命科学系学会合同年次大会.
• [Presentation] End malaria-マラリアのeliminationをめざして アルテミシニン耐性の評価・検出ツールは出そろったか? 流行地でのフィールド調査から見えてきた問題点. (2017)
  • Author(s): 美田敏宏
  • Organizer: 生命科学系学会合同年次大会.
  • Invited
• [Presentation] 人類を助ける進化学研究：進化し続ける薬剤耐性マラリアの克服. (2017)
  • Author(s): 美田敏宏
  • Organizer: 公益信託 進化学振興木村資生基金 “微生物と人類の共存”をゲノムの視点から考える.
  • Invited
• [Presentation] ウガンダにおけるin vivo薬剤耐性試験およびRSAを用いたアルテミシニン耐性疫学調査. (2017)
  • Author(s): 池田美恵, 橘真一郎, 山内祐人, Auma M, 関原誠, 森稔幸, 平井誠, Palacpac N, 木村英作, Aginya E, 堀井俊宏, 美田敏宏.
  • Organizer: 第86回日本寄生虫学会大会
• [Presentation] ウガンダ国の熱帯熱マラリア患者において腸内細菌叢の変化が起こる. (2017)
  • Author(s): 谷口委代, 宮内栄治, OliaAlex, 長安英治, OsbertKaturo, 鈴江一友, 今井孝, 下川周子, 大西里咲, I. O-A, PalacpacNirianne, 丸山治彦, 木村英作, 美田敏宏, 大野博司, 堀井俊宏, 久枝一.
  • Organizer: グローバルヘルス合同大会プログラム・抄録集.
• [Presentation] ネズミマラリア原虫の有性生殖関連分子の機能解析. (2017)
  • Author(s): 前多晟壮, 森稔幸, 平井誠, 美田敏宏.
  • Organizer: 第86回日本寄生虫学会大会
• [Presentation] マラリア原虫有性生殖の透視観察法の開発 (2017)
  • Author(s): 森稔幸, 平井誠, 美田敏宏
  • Organizer: 第86回日本寄生虫学会大会
• [Presentation] ウガンダにおける熱帯熱マラリア原虫キニーネ感受性の実態. (2017)
  • Author(s): 山内祐人, 橘真一郎, 池田美恵, 関原誠, Balikagala B, 八代-櫻井美樹, 平井誠, Palacpac N, 木村英作, 堀井俊宏, 美田敏宏.
  • Organizer: 第86回日本寄生虫学会大会
• [Presentation] 線虫ミトコンドリアのプロテオーム解析 二次元電気泳動法とショットガン質量分析. (2017)
  • Author(s): 高宮信三郎, 數野彩子, 峯木礼子, 三浦芳樹, 美田敏宏.
  • Organizer: 生命科学系学会合同年次大会
• [Presentation] Ascaris suum 成虫およびCaenorhabditis elegans ミトコンドリアのプロテオーム解析: 二次元ゲル電気泳動法とショットガン質量分析法. (2017)
  • Author(s): 高宮信三郎, 数野彩子, 峯木礼子, 三浦芳樹, 美田敏宏
  • Organizer: 第86回日本寄生虫学会大会
• [Presentation] 宿主内競争による熱帯熱マラリア原虫のクロロキン感受性の回復. (2017)
  • Author(s): 橘真一郎, 池田美恵, Balikagala B, 櫻井美樹, 八代聖基, 関原誠, 山内祐人, Auma MA, 平井誠, 森稔幸, Palacpac N, 片岡正俊, 木村英作, 堀井俊宏, 美田敏宏.
  • Organizer: 第86回日本寄生虫学会大会
• [Presentation] Epidemiology of antimalarial drug resistance in Papua New Guinea. (2017)
  • Author(s): 関原誠, 橘真一郎, 美田敏宏.
  • Organizer: 第86回日本寄生虫学会大会
• [Presentation] Prerequisite Emergence of Background Mutations For Kelch13-Related Artemisinin-Resistant Plasmodium Falciparum Isolates. (2017)
  • Author(s): Tachibana S-I, Mori T, Hirai M, Mita T
  • Organizer: American Society of Tropical Medicine and Hygiene 66th Annual Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Development of See-Through Imaging Methods for Sexual Reproduction of Malaria Parasites. (2017)
  • Author(s): Mori T, Hirai M, Mita T
  • Organizer: American Society of Tropical Medicine and Hygiene 66th Annual Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Detection of artemisinin-resistant Plasmodium falciparum isolates with ex-vivo ring-stage survival assay in Uganda. (2017)
  • Author(s): Mita T, Ikeda M, Kaneko M, Balikagala B, Tachibana S-I, Sakurai-Yatsushiro M, Yatsushiro S, Takahashi N, Hashimoto M, Katuro O, Olia A, Obwoya P, Auma M, Anywar D, Odongo-Aginya E, Hirai M, Palacpac N, Kataoka M, Tsuboi T, Kimura E, Horii T.
  • Organizer: Keystone Symposia Conference: Malaria:
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] A mutator Plasmodium berghei model to investigate antimalarial drug resistance. (2017)
  • Author(s): Mita T
  • Organizer: American Society of Tropical Medicine and Hygiene 66th Annual Meeting
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Pb102, A Novel Gene Essential for Female Fertility or Ookinete Maturation of Murine Malaria Parasite, Plasmodium Berghei. (2017)
  • Author(s): Maeta A, Hirai M, Mori T, Mita T
  • Organizer: American Society of Tropical Medicine and Hygiene 66th Annual Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Application of a cell microarray chip system for accurate, highly sensitive, and rapid diagnosis for malaria. (2017)
  • Author(s): Kataoka M, Yatsushiro S, Yamamoto T, Oka H, Okello-Onen J, Odongo-Aginya E, Palacpac N, Mita T, Baba Y, Horii T.
  • Organizer: Keystone Symposia Conference: Malaria
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Isolation of Piperaquine Resistant Rodent Malaria Parasite from Mutator Malaria. (2017)
  • Author(s): Hirai M, Ikeda M, Tachibana S-I, Mita T
  • Organizer: American Society of Tropical Medicine and Hygiene 66th Annual Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Patent(Industrial Property Rights)] マラリア原虫の増殖抑制剤 (2019)
  • Inventor(s): 美田敏宏、久保原禅
  • Industrial Property Rights Holder: 美田敏宏、久保原禅
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2019