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放線菌由来新規ニトロ化酵素の同定と芳香族ジアミン生産系の開発

Research Project

Project/Area Number 17J06071
Research Category

Grant-in-Aid for JSPS Fellows

Allocation TypeSingle-year Grants
Section国内
Research Field Applied microbiology
Research InstitutionThe University of Tokyo

Principal Investigator

冨田 宏矢  東京大学, 農学生命科学研究科, 特別研究員(PD)

Project Period (FY) 2017-04-26 – 2020-03-31
Project Status Completed (Fiscal Year 2019)
Budget Amount *help
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2018: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2017: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Keywords生合成 / 放線菌 / シトクロムP450 / ニトロ化 / Streptomyces / 天然物 / 非リボソームペプチド / 二次代謝
Outline of Annual Research Achievements

RufOの結晶構造解析で電子密度が観測されないループ部分に関する知見を得るため、共同研究による計算科学を用いてループ領域の挙動を予測し、酵素活性や基質認識に重要な役割を果たすアミノ酸残基の同定を試みることにした。すでに得られているX線結晶構造のデータをもとにMD計算、量子化学計算を行い、チロシンや一酸化窒素の結合のシミュレーションをマイクロ秒スケールで進めた。活性中心のヘム鉄は、ニトロ化反応が起こる状態と予想されるペルオキシナイトライトが配位したものを用いた。これまでの結果からは重要なアミノ酸残基の同定には至っていないものの、今後いくつかの変異体の作製およびその酵素活性の変化を併せて進めることで、酵素反応のメカニズムに迫ることができると考えられる。また、酵素学的に非常に珍しいニトロ化反応の反応機構に関する知見を得るため、ペルオキシナイトライトを用いた酵素反応試験を行った。一般的な水酸化反応を触媒するシトクロムP450酵素の場合、フェレドキシンから供給される電子を用いて分子状酸素を還元的に活性化するが、過酸化水素を用いることでフェレドキシン/フェレドキシン還元酵素および酸素を用いずにこの触媒サイクルをバイパスできることが知られる。そこでRufOによるニトロ化反応でも同様の反応が行えるかどうかを調べるため、本来の酵素反応に必要なフェレドキシン/フェレドキシン還元酵素と一酸化窒素の代わりにペルオキシナイトライトを加えて実験を行った。その結果、ペルオキシナイトライトでもニトロ化反応が進行することが明らかとなった。この結果は、ニトロ化反応を触媒するシトクロムP450酵素がペルオキシナイトライト中間体を経由するとの予想反応機構を支持するものと考えられる。

Research Progress Status

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Report

(3 results)
  • 2019 Annual Research Report
  • 2018 Annual Research Report
  • 2017 Annual Research Report
  • Research Products

    (8 results)

All 2019 2018 2017 Other

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Presentation (6 results) (of which Int'l Joint Research: 4 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Identification and characterization of a bacterial cytochrome P450 monooxygenase catalyzing the 3-nitration of tyrosine in rufomycin biosynthesis2017

    • Author(s)
      Hiroya Tomita, Yohei Katsuyama, Hiromichi Minami, and Yasuo Onishi
    • Journal Title

      Journal of Biological Chemistry

      Volume: 292 Issue: 38 Pages: 15859-15869

    • DOI

      10.1074/jbc.m117.791269

    • Related Report
      2017 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Genome mining for novel nitrating cytochrome P450s provides insights into lajollamycin biosynthesis2019

    • Author(s)
      Hiroya Tomita, Yohei Katsuyama, Yasuo Ohnishi
    • Organizer
      The 4th A3 foresight symposium on Chemistry & Biology of Natural Products
    • Related Report
      2019 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] ラホヤマイシン生合成に関与する脂肪族ニトロ化酵素に関する研究2019

    • Author(s)
      冨田宏矢、勝山陽平、大西康夫
    • Organizer
      日本農芸化学会2020年度大会
    • Related Report
      2019 Annual Research Report
  • [Presentation] Directed evolution of an aromatic N-oxygenase for modifying its regioselectivity2018

    • Author(s)
      Hiroya Tomita, Yohei Katsuyama, and Yasuo Ohnishi
    • Organizer
      The 3rd A3 foresight symposium on Chemistry & Biology of Natural Products
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Regioselectivity Modification of Arylamine N-oxygenase by Directed Evolution2018

    • Author(s)
      Hiroya Tomita, Yohei Katsuyama, and Yasuo Ohnishi
    • Organizer
      ASBA2018
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 芳香族アミノ基酸化酵素の位置選択性改変系の構築2018

    • Author(s)
      冨田宏矢、勝山陽平、大西康夫
    • Organizer
      日本農芸化学会 2018 年度大会
    • Related Report
      2017 Annual Research Report
  • [Presentation] Identification and characterization of a novel cytochrome P450 catalyzing tyrosine nitration in rufomycin biosynthesis2017

    • Author(s)
      Hiroya Tomita, Yohei Katsuyama, and Yasuo Onishi
    • Organizer
      18th International Symposium on the Biology of Actinomycetes
    • Related Report
      2017 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Remarks] 放線菌が持つチロシンニトロ化酵素の発見

    • URL

      http://www.a.u-tokyo.ac.jp/topics/2017/20171211-1.html

    • Related Report
      2017 Annual Research Report

URL: 

Published: 2017-05-25   Modified: 2024-03-26  

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