動物の動脈硬化における免疫グロブリンと脂質代謝関連分子の役割について

• Project/Area Number: 17J09424
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Veterinary medical science
• Research Institution: The University of Tokyo
• Research Fellow: 潮 奈々子 東京大学, 農学生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2017-04-26 – 2021-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000); Fiscal Year 2019: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000); Fiscal Year 2018: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000); Fiscal Year 2017: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
• Keywords: 免疫グロブリン / アポリポプロテイン / アミロイド / 脂質プロファイル / 粥状硬化 / アポリポ蛋白

Outline of Annual Research Achievements

高齢犬の冠動脈にはヒトに多い粥状動脈硬化は稀であるが、約30%のイヌに、硝子様物質沈着による硬化病変が生じることが知られており、突然死や弁膜症の原因となることが示されている。硝子様動脈硬化の中でも、アミロイド沈着による硬化血管では、内腔の著しい狭小化が生じることから、その病的意義の評価や病理発生機序の解明が必要と考える。平成29年度の研究により、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から抽出したサンプルをHPLCにより分離し、質量分析を行った結果、Apolipoprotein A1が検出された。しかし、免疫組織学的手法で検出される免疫グロブリンがHPLC-MS/MSでは検出されなかった。これは、免疫グロブリンが非常に多様性に富むタンパク質であり、データベースに登録されているイヌの免疫グロブリンの種類が非常に少ないことが原因として考えられた。したがって、平成30年度は凍結材料を用いて、アミロイド構成タンパク質を解析するとともに、冠動脈のアミロイド沈着による循環障害の影響を検討した。
凍結材料を用いた免疫組織学的な検索では、ホルマリン固定パラフィン包埋組織を用いた解析で検出されなかった免疫グロブリンがアミロイド沈着部位に広く共局在していた。また、凍結組織を用いて行ったSDS-PAGEおよびウェスタンブロット解析では約15kDaの位置にコントロール症例では検出されないバンドが検出された。次に、心臓組織の３Dモデルを作成し、冠動脈のアミロイド沈着によって血流障害が生じるか検討した結果、壁外冠動脈から壁内に走行する大型の壁内冠動脈から分岐する動脈にアミロイドが沈着し、動脈周囲の線維化が著しいことが明らかになった。また症例犬と正常犬の脂質プロファイルを作成した結果、症例犬は正常犬に比べて、超低比重リポタンパクや低比重リポタンパクの値が高く、高比重リポタンパク(HDL)は低かった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成29年度の結果からアミロイド構成タンパク質としてアポリポプロテインA1である可能性が考えられたが、免疫組織学的な検索ではアミロイド沈着部位の一部に共局在するのみだった。したがって、平成30年度はホルマリン固定による抗原性の失活を考慮して、凍結材料を用いた解析を主に行った。その結果、アポリポプロテインA1の他に、アミロイド沈着部位に広く共局在する免疫グロブリンが検出された。この免疫グロブリンは今までホルマリン固定パラフィン包埋組織を用いた検索では検出されなかったことから、ホルマリン固定によって抗原性が失活することがわかった。さらに、凍結組織の生化学的な解析では約15kDaの位置にコントロール検体では検出されなかったバンドが検出された。しかし、タンパク質の同定には至らなかった。今後はアミロイドに特異的な抽出を行い、タンパク質の同定を行う。次に、3Dモデルの構築により冠動脈のアミロイド沈着による血流障害の影響を検討した結果、アミロイドが沈着した血管周囲で線維化が認められた。今後は検体数を増やすとともに、より解像度を上げた3Dモデルを構築する。

Strategy for Future Research Activity

次年度は凍結組織を用いてダイセクションを行い、血管に沈着したアミロイドの構成タンパク質を生化学的に解析する。タンパク質が同定できなかった場合は、プロテインシーケンサーを用いてタンパク質のアミノ酸配列を解析する。さらに、同定されたアミノ酸配列またはタンパク質に対する抗体を作成し、免疫電子顕微鏡法によってアミロイド構成タンパク質であることを確認する。また複数の検体について、バーチャルスライドを用いて3Dモデル構築を行う。次に平成29年度の解析では、アミロイド沈着部位にApolipoproteinBやLDL受容体が検出されたことから、免疫電子顕微鏡法を用いてアミロイド線維と上述の脂質関連分子がどのように局在しているかを解析する。