ゲノム編集技術を用いたブタ胚着床促進因子の同定と効率的家畜生産技術への応用

Research Project

Project/Area Number	17J11050
Research Category	Grant-in-Aid for JSPS Fellows
Allocation Type	Single-year Grants
Section	国内
Research Field	Animal production science
Research Institution	Azabu University
Research Fellow	鴨下真紀麻布大学, 獣医学研究科, 特別研究員(PD)
Project Period (FY)	2017-04-26 – 2019-03-31
Project Status	Completed (Fiscal Year 2018)
Budget Amount *help	¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000) Fiscal Year 2018: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000) Fiscal Year 2017: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Keywords	ゲノム編集 / CRISPR/Cas / ブタ / 前核期胚 / ガラス化保存 / CRISPR/Cas9 / 白血病阻止因子 / LIF / 超低温保存 / 胚発生率
Outline of Annual Research Achievements	・ブタ前核期胚のLIF gRNAおよびCas9 mRNA/タンパク質注入条件の検討食肉処理場由来の卵巣より回収した未成熟卵を体外成熟培養し、得られた成熟卵を凍結融解精子と体外受精し、前核期胚を得た。様々な濃度のgRNAとCas9 mRNAを注入した前核期胚の胚盤胞率およぼ胚盤胞でのゲノム変異率を調べたところ、5 ng/uLから50 ng/uLまでのgRNAおよびCas9 mRNA注入濃度はブタ前核期胚の胚盤胞への発生率に影響を及ぼさないことを示したが、変異導入効率では25 ng/uLが50%と最も高いことが明らかになった。同様に、ブタ前核期胚のLIF gRNAおよびCas9タンパク質注入条件を検討したところ、胚盤胞率では試験区間に有意な差はみられなかったが、25および50 ng/uLでは高い効率でゲノム変異胚が得られた。・ガラス化保存したブタ前核期胚のLIF gRNAおよびCas9 mRNA/タンパク質注入試験体外生産由来のブタ前核期胚を多量に作出するのは容易ではなく、個体作出を目的とした胚移植に用いる胚をより効率的に準備する必要が求められた。そこで新規凍害保護物質であるCOOH-PLLを添加したガラス化保存液を用いてブタ前核期胚をガラス化保存し、加温後に同様の方法でLIF gRNAおよびCas9 mRNA/タンパク質を注入し、胚盤胞への発生能を調べた。その結果、gRNAおよびCas9 mRNAあるいはタンパク質を注入したガラス化保存前核期胚は胚盤胞へ発生し、さらにゲノム変異胚を確認した。ガラス化保存したブタ前核期胚を用いて顕微注入を行い、その後に胚盤胞への発生を確認したのは本研究がはじめてであり、さらに低率ながらゲノム変異胚が作製できることもはじめて明らかになった。
Research Progress Status	平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
Strategy for Future Research Activity	平成30年度が最終年度であるため、記入しない。