細胞脂質解析のための生体触媒モジュールの開発

Research Project

Project/Area Number	18038026
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
Allocation Type	Single-year Grants
Review Section	Science and Engineering
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	小川順京都大学, 農学研究科, 助手 (70281102)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	清水昌京都大学, 農学研究科, 教授 (70093250) 片岡道彦京都大学, 農学研究科, 助教授 (90252494) 櫻谷英治京都大学, 農学研究科, 助手 (10362427)
Project Period (FY)	2006
Project Status	Completed (Fiscal Year 2006)
Budget Amount *help	¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000) Fiscal Year 2006: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
Keywords	脂質 / P450 / ペルオキシダーゼ / リパーゼ / 脂肪酸 / 変異型酵素 / 過酸化水素 / NADPH
Research Abstract	脂質・脂肪酸分子種の網羅的解析技術の開発は、その生命活動における重要性にも関わらず、他の分子種に比べ遅れている。将来的に、細胞非侵襲的かつ連続的な時系列での分析を可能とするためには、新たな手法の開発が必要である。生体触媒モジュール(酵素)を用いる分析法は、その基盤技術になると考える。本研究では、脂質・脂肪酸分子種の酵素分析法として、1)脂質クラス特異的脂肪酸遊離酵素(リパーゼ、ホスホリパーゼ、グリコリパーゼ、セラミダーゼ等)による遊離脂肪酸の生成、2)遊離脂肪酸のシトクロームP450による分子種分別、3)シトクロームP450反応生成物(過酸化物)のペルオキシダーゼ反応によるモニタリング、の3ステップにより構成される系の構築を試みた。本年度は、本分析系においてセンシングの要となるシトクロームP450の開発に重点をおいた研究を行い、Bacillus megaterium由来シトクロームP450 BM-3の変異型酵素を作成し、その様々な脂肪酸に対する反応性を検証した。すなわち、脂肪酸選択性に影響を与えるアミノ酸残基を選抜し、変異型酵素F87Y、A74G/F87v/L188Qを設計した。また、N末にHis-tagを有する上記変異型酵素の大腸菌にお高発現系、ならびに簡易精製法を確立した。さらに、変異型酵素ならびに野生型酵素につき、各脂肪酸下でのNADPH消費速度を比較検討した。その結果、変異型酵素において、不飽和脂肪酸に対する基質特異性が変化していることを確認した。また、過酸化水素(活性酸素)消去系の存在下にてNADPH消費速度の変化を認め、過酸化水素の発生が予想された。