Development of polymeric micelles for photothermal/suicide gene therapy combined with immune checkpoint blockage

Research Project

Project/Area Number	18F18368
Research Category	Grant-in-Aid for JSPS Fellows
Allocation Type	Single-year Grants
Section	外国
Review Section	Basic Section 90120:Biomaterials-related
Research Institution	Kawasaki Institute of Industrial Promotion Innovation Center of NanoMedicine
Host Researcher	片岡一則公益財団法人川崎市産業振興財団(ナノ医療イノベーションセンター), ナノ医療イノベーションセンター, センター長 (00130245)
Foreign Research Fellow	WANG ZHENG 公益財団法人川崎市産業振興財団(ナノ医療イノベーションセンター), ナノ医療イノベーションセンター, 外国人特別研究員 Wang Zheng 公益財団法人川崎市産業振興財団(ナノ医療イノベーションセンター), ナノ医療イノベーションセンター, 外国人特別研究員
Project Period (FY)	2018-11-09 – 2021-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2020)
Budget Amount *help	¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000) Fiscal Year 2020: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000) Fiscal Year 2019: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000) Fiscal Year 2018: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000)
Keywords	高分子ミセル / ドラッグデリバリーシステム / がん免疫療法 / 免疫チェックポイント阻害剤 / mRNA / 遺伝子治療 / 抗体
Outline of Annual Research Achievements	遺伝子治療はがんに対する有望な治療戦略として期待されており、数多くの臨床試験が行われている。メッセンジャー（m）RNA医薬は、非分裂細胞を含めたあらゆる細胞に対して安全かつ効率的に導入できるため近年注目されている。一方で、免疫チェックポイント阻害抗体を用いたがん免疫療法は、様々ながんに対する強い有効性が実証されつつある。そこで本研究では、mRNA医薬を利用した免疫チェックポイント阻害抗体の産生に基づくがん免疫療法の構築を目的とする。本年度は、mRNAにコードする免疫チェックポイントのPD-1/PD-L1経路を標的とする抗PD-L1抗体の単鎖抗体(scFv)の構築とmRNAを内包する高分子ミセルの構築に取り組んだ。抗PD-L1抗体としては、がん疾患モデルでの実験を考慮し、承認薬アベルマブを選択した。得られたアベルマブ配列を有するscFvは、熱安定性に優れ、PD-L1分子に対して強い親和性を示すことが確認された。標的細胞で翻訳されたscFvは、細胞外へ分泌される必要があるうえ、そのin vitroおよびin vivoにおける挙動を評価できることが求められる。そこで、アベルマブの配列を持つscFvに対して、ヒトインターロイキン2由来の分泌シグナル配列と蛍光タンパク質のGFPあるいはFLAGタグを結合したscFvを設計した。また、mRNAを内包する高分子ミセルの構築については、化学構造の異なるポリカチオンを複数合成し、mRNAとの結合力を評価した。さらに、ポリカチオンに対して化学架橋を導入することによって、高分子ミセルの生体内における安定性が向上することを確認した。初年度のうちに、in vitroおよびin vivoの評価に進むなど、当初の予定を上回る進捗を得ている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 1: Research has progressed more than it was originally planned. Reason 免疫チェックポイント阻害抗体のscFvを発現するmRNAの設計とmRNAを内包する高分子ミセルの構築について、次のような特筆すべき成果を得た。 (1) 免疫チェックポイント阻害抗体として、既に承認されているアベルマブを選択し、その配列を有するscFvの調製に成功した。得られたscFvは、熱安定性に優れ、PD-L1分子に対する強い親和性を持つことが確認された。 (2) scFvがPD-1/PD-L1経路を阻害するためには、細胞内で翻訳されたscFvが細胞外に分泌される必要がある。また、scFvのin vitroおよびin vivoにおける挙動を評価するためには、scFvにリアルタイムの検出が可能な標識を施すことが求められる。そこで、ヒトインターロイキン2由来の分泌シグナルおよびGFPあるいはFLAGタグを結合したscFvを設計した。 (3) mRNAが標的細胞に取り込まれるためには、生体内でmRNAを安定に担持するキャリアが必要である。そのためのキャリアとして、本研究では、ポリエチレングリコール(PEG)－ポリカチオンを材料とする高分子ミセルを利用するが、本年度は、ポリカチオン鎖の化学構造の最適化に取り組んだ。その過程において、ポリカチオン鎖の化学構造の最適化とポリカチオン鎖に導入する架橋構造の選別が進み、生体内環境においてmRNAを安定に担持できる高分子ミセルを得ることができた。 (4) 治療効果を評価するためのがん疾患モデルとして、グリオブラストーマの同所移植モデルの構築に成功した。以上のように、当初の計画に従ってmRNAの設計を完了し、mRNAを内包する高分子ミセルの最適化が進んでいることに加え、得られた高分子ミセルのin vitroおよびin vivoにおける評価が進むなど、当初の計画を超える進捗があった。
Strategy for Future Research Activity	上述したように、本研究は当初の計画を上回る進捗を得ているため、本年度は、当初の計画を前倒することで、次のように研究を実施する。 (1) 前年度に得られたアベルマブ配列、分泌シグナル配列、GFPあるいはFLAGタグ配列を有するscFvをコードしたmRNAを調製する。 (2) 得られたmRNAをグリオブラストーマ細胞に導入し、scFvの細胞外に対する分泌挙動と分泌されたscFvのPD-L1分子に対する親和性を評価する。 (3) 前年度に引き続き、高分子ミセルの材料となるPEG－ポリカチオンの化学構造や架橋構造の最適化に取り組むとともに、それを利用してmRNAを内包する高分子ミセルを構築する。最終的には、粒径が100 nm以下、表面電荷が中性、かつ十分な酵素耐性を有する高分子ミセルを得ることを目標とする。得られた高分子ミセルは、グリオブラストーマ細胞に導入し、mRNAにコードされたscFvの細胞外分泌挙動やPD-L1分子に対する親和性の評価を実施する。 (4) グリオブラストーマの同所移植モデルに対して、構築したmRNA内包高分子ミセルを腫瘍内投与し、mRNA内包高分子ミセルによるscFvの産生効率やがん細胞のPD-L1分子に対する結合挙動、さらには、免疫チェックポイントの阻害に伴う抗腫瘍効果の評価に取り組む。