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EOSIN蛍光の応用によるミクロ組織解析法

Research Project

Project/Area Number 18H00342
Research Category

Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists

Allocation TypeSingle-year Grants
Review Section 3120:Biology at molecular to cellular levels, biology at cellular to organismal levels, biology at organismal to population levels and anthropology, neuroscience and related fields
Research InstitutionEhime University

Principal Investigator

首藤 政親  愛媛大学, 学術支援センター, 技術専門員

Project Period (FY) 2018
Project Status Completed (Fiscal Year 2018)
Budget Amount *help
¥480,000 (Direct Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2018: ¥480,000 (Direct Cost: ¥480,000)
KeywordsEOSIN蛍光 / レーザー顕微鏡 / 電子顕微鏡
Outline of Annual Research Achievements

本研究では、ノーマルマウスレベルでの、血管内腔蛍光3Dでの微細形態取得により血管変性部位を特定し、透過型電子顕微鏡で微細形態変化を捉える事を目指した。脳の片方の海馬領域までの手法は確立しているため、次の段階として腎臓に着手した。成功すれば、広範囲への展開と応用が可能になり、血管関連疾患の基礎研究に大いに貢献できる。
実験手順は、「還流固定(GA2%+PFA4%、PFA4%)→EOSIN1%+青色蛍光ビーズ溶液を流し込み血管腔内の鋳型生成→氷温冷却→1~2 mm厚切片の組織作成→マイクロスライサーで、50~100μm厚切片作成→ヘキスト核染色→封入→レーザー顕微鏡撮影・画像取得→免疫電子顕微鏡試料作製・撮影」であり、改良箇所と結果は以下のとおりである。
還流固定(GA2%+PFA4%)では、脳全体の血管にほぼ行き渡ったが、還流固定(PFA4%)は、ゼラチン12%以下の水溶液しか腎臓内の血管に行き渡らず、この濃度ではEOSIN溶液の血管外流失が多くなるため、免疫電顕への応用に課題が残った。
EOSIN 1%+青色蛍光ビーズ溶液の作製手順は以下のように改良を加えた。
1. EOSIN0.5gをカコジル酸緩衝液(pH7.0)50mlで、50~80℃にて撹拌して完全に溶く。2. 牛皮膚ゼラチン7.5gを少しずつ加えて完全に加熱撹拌溶解させる。3. Agarose Sを0.15g徐々に加えて溶解させる。4. 青色蛍光ビーズ0.5μm0.5ml加えて少し撹拌する。若しくは、EOSIN溶液の粘性を弱め、血管鋳型形成を助けるため、牛皮膚由来ゼラチン15%水溶液を加熱撹拌溶解後に、HC1を滴下しpHを1以下して5秒間撹拌しコラーゲンのアスパラギン酸・プロリン結合の一部分解し、NaOHを滴下してpH6.5に戻す。
上記の結果、EOSIN1%+牛皮膚ゼラチン(Type B : G9382 Sigma)15%+Agarose S 0.15%+青色蛍光ビーズ(Bay bioscience社)0.5μm1%inカコジル酸緩衝液(pH6.8)溶液が、最も優れている事が判明した。
腎臓での手法の確立という段階には至らなかったが、還流固定やEOSIN1%+青色蛍光ビーズ溶液の作製手順の改良を行う中で、コラーゲン等、新たな材料の発見があった。これは、他の臓器にも応用可能な利用価値の高いものであると考える。

Report

(1 results)
  • 2018 Annual Research Report

Research Products

(2 results)

All 2019

All Journal Article (1 results) Presentation (1 results) (of which Invited: 1 results)

  • [Journal Article] EOSIN蛍光の応用によるミクロ組織解析法2019

    • Author(s)
      首藤政親
    • Issue
      41
    • ISSN
      02853299
    • Description
      in press
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
  • [Presentation] EOSIN蛍光の応用によるミクロ組織解析法2019

    • Author(s)
      首藤政親
    • Organizer
      第15回奨励研究採択課題技術シンポジウム
    • Place of Presentation
      生理学研究所(愛知県)
    • Year and Date
      2019-02-15
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Invited

URL: 

Published: 2018-04-23   Modified: 2020-03-17  

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