| Project/Area Number |
18H00342
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
3120:Biology at molecular to cellular levels, biology at cellular to organismal levels, biology at organismal to population levels and anthropology, neuroscience and related fields
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
首藤 政親 愛媛大学, 学術支援センター, 技術専門員
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| Project Period (FY) |
2018
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2018)
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| Budget Amount *help |
¥480,000 (Direct Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2018: ¥480,000 (Direct Cost: ¥480,000)
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| Keywords | EOSIN蛍光 / レーザー顕微鏡 / 電子顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ノーマルマウスレベルでの、血管内腔蛍光3Dでの微細形態取得により血管変性部位を特定し、透過型電子顕微鏡で微細形態変化を捉える事を目指した。脳の片方の海馬領域までの手法は確立しているため、次の段階として腎臓に着手した。成功すれば、広範囲への展開と応用が可能になり、血管関連疾患の基礎研究に大いに貢献できる。
実験手順は、「還流固定(GA2%+PFA4%、PFA4%)→EOSIN1%+青色蛍光ビーズ溶液を流し込み血管腔内の鋳型生成→氷温冷却→1～2 mm厚切片の組織作成→マイクロスライサーで、50～100μm厚切片作成→ヘキスト核染色→封入→レーザー顕微鏡撮影・画像取得→免疫電子顕微鏡試料作製・撮影」であり、改良箇所と結果は以下のとおりである。
還流固定(GA2%+PFA4%)では、脳全体の血管にほぼ行き渡ったが、還流固定(PFA4%)は、ゼラチン12%以下の水溶液しか腎臓内の血管に行き渡らず、この濃度ではEOSIN溶液の血管外流失が多くなるため、免疫電顕への応用に課題が残った。
EOSIN 1%+青色蛍光ビーズ溶液の作製手順は以下のように改良を加えた。
1. EOSIN0.5gをカコジル酸緩衝液(pH7.0)50mlで、50～80℃にて撹拌して完全に溶く。2. 牛皮膚ゼラチン7.5gを少しずつ加えて完全に加熱撹拌溶解させる。3. Agarose Sを0.15g徐々に加えて溶解させる。4. 青色蛍光ビーズ0.5μm0.5ml加えて少し撹拌する。若しくは、EOSIN溶液の粘性を弱め、血管鋳型形成を助けるため、牛皮膚由来ゼラチン15%水溶液を加熱撹拌溶解後に、HC1を滴下しpHを1以下して5秒間撹拌しコラーゲンのアスパラギン酸・プロリン結合の一部分解し、NaOHを滴下してpH6.5に戻す。
上記の結果、EOSIN1%+牛皮膚ゼラチン(Type B : G9382 Sigma)15%+Agarose S 0.15%+青色蛍光ビーズ(Bay bioscience社)0.5μm1%inカコジル酸緩衝液(pH6.8)溶液が、最も優れている事が判明した。
腎臓での手法の確立という段階には至らなかったが、還流固定やEOSIN1%+青色蛍光ビーズ溶液の作製手順の改良を行う中で、コラーゲン等、新たな材料の発見があった。これは、他の臓器にも応用可能な利用価値の高いものであると考える。
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Report
(1 results)
Research Products
(2 results)
