酵素反応を駆使した金属イオン応答性DNA超分子の創製
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18H02081
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 37010:Bio-related chemistry
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
竹澤 悠典 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (70508598)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2020)
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| Budget Amount *help |
¥17,290,000 (Direct Cost: ¥13,300,000、Indirect Cost: ¥3,990,000)
Fiscal Year 2020: ¥5,850,000 (Direct Cost: ¥4,500,000、Indirect Cost: ¥1,350,000)
Fiscal Year 2019: ¥5,330,000 (Direct Cost: ¥4,100,000、Indirect Cost: ¥1,230,000)
Fiscal Year 2018: ¥6,110,000 (Direct Cost: ¥4,700,000、Indirect Cost: ¥1,410,000)
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| Keywords | DNA / 核酸化学 / 超分子化学 / 金属錯体 / 酵素反応 / 人工DNA / 金属錯体型人工塩基対 / DNAポリメラーゼ / デオキシリボザイム / DNAナノテクノロジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、種々のDNA合成酵素を駆使した金属配位子型人工DNAの効率的な酵素合成法を開発し、金属錯体型塩基対形成を駆動力として構造・機能のスイッチングが可能な金属イオン応答性DNA超分子を創製することを目的としている。本年度は、Cu(II)イオン存在下で金属錯体型塩基対H-Cu(II)-Hを形成するヒドロキシピリドン型ヌクレオチド(H)を用い、（１）DNAポリメラーゼによる金属配位子型ヌクレオシドの挿入反応、および（２）金属錯体型塩基対形成により活性制御ができるデオキシリボザイム(DNAzyme)の開発を行った。
（１）DNAポリメラーゼとしてクレノウフラグメント(3’→5’ exo-)を用い、鋳型鎖上の塩基をAもしくはTにしたときに、Hヌクレオチドが効率よく導入されることを見出した。Hの一塩基伸長の後、さらにDpo IVポリメラーゼと天然ヌクレオチドを加えると、引き続き伸長反応が進行した。以上により、Hヌクレオチドを含む人工DNA鎖の酵素合成が可能になった。
（２）RNA切断活性を有する既報のDNAzymeを2本のDNA鎖に分割し、それぞれのステム部位にHヌクレオチドを導入した。H-Cu(II)-H塩基対の形成により、分割したDNA鎖が会合して活性部位が再構成され、DNAzymeの活性が回復する設計である。DNA鎖の長さやHの導入箇所の最適化の結果、1当量のCu(II)イオンの添加により活性が5.5倍上昇するCu(II)イオン応答性DNAzymeを開発できた。Cu(II)イオンとキレート剤とを交互に加えることで、触媒活性の繰り返し制御も実現された。
以上のように、DNAポリメラーゼを利用した配位子型人工DNA鎖の酵素合成法を確立し、さらに金属錯体型塩基対H-Cu(II)-Hの形成により活性が制御できるDNAzymeの開発に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、金属配位子型人工DNA鎖の酵素合成に基づく金属イオン応答性機能性核酸・DNA超分子の創製を目指しており、本年度は以下の結果を得た。
（１）天然DNAを鋳型鎖としたDNAポリメラーゼによる酵素反応により、ヒドロキシピリドン型ヌクレオシド(H)を導入した金属配位子型人工DNA鎖の酵素合成法を確立した。特に、Hヌクレオチドの前後の配列によらず、酵素合成が可能であることも示された。
（２）Hヌクレオチドの導入により、金属錯体型塩基対H-Cu(II)-Hの形成により活性が可逆に制御できるスプリット型のデオキシリボザイム(DNAzyme)の開発に成功した。
（３）得られたDNAzymeの触媒活性は、Cu(II)イオンの添加および除去により繰り返し制御することができた。Cuの酸化還元による活性制御も可能であり、また、高い金属イオン選択性があることも示された。
Cu(II)イオン存在下・非存在下におけるDNAzyme活性の比が低いなどの課題は残るものの、おおむね順調に進展していると判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、DNAポリメラーゼを利用した配位子型人工DNA鎖の酵素合成法の開発、およびCu(II)錯体型人工塩基対の形成により活性が制御できるデオキシリボザイム(DNAzyme)の開発を行った。
次年度以降は、DNAリガーゼなどの酵素を用いた酵素合成法の改良や、複数の配位子型人工ヌクレオチドの連続導入法の開発を行う。さらに、ヒドロキシピリドン型ヌクレオチド以外の配位子型人工ヌクレオチドの酵素による導入も検討する。
これらの酵素合成法を駆使して、金属イオンに応答するデオキシリボザイムやアロステリック応答を示すDNA超分子の開発を行う。さらに、複数種の金属錯体型人工塩基対を導入することで、複数の金属イオンに応答して構造・機能が変換するロジックゲート型のDNA超分子の創製も目指す。
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Report
(1 results)
Research Products
(14 results)
