Development of a molecular delivery system targeting to fish eggs: mass-production of the transporter by bio-reactor

Research Project

Project/Area Number	18H02272
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Allocation Type	Single-year Grants
Section	一般
Review Section	Basic Section 40040:Aquatic life science-related
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	平松尚志北海道大学, 水産科学研究院, 准教授 (10443920)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	東藤孝北海道大学, 水産科学研究院, 准教授 (60303111)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2023-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2021)
Budget Amount *help	¥17,160,000 (Direct Cost: ¥13,200,000、Indirect Cost: ¥3,960,000) Fiscal Year 2021: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000) Fiscal Year 2020: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000) Fiscal Year 2019: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000) Fiscal Year 2018: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Keywords	バイオリアクター / ビテロジェニン / 魚卵 / 物質輸送 / 分子輸送 / 卵 / メダカ / 生物工学
Outline of Annual Research Achievements	本研究は魚類の卵や仔魚へ様々な有効物質を輸送する分子輸送システムを開発することを目標とする。本年度は以下の成果を得た。１．トラウトビテロジェニンプロモーター（tVGP）制御下で3種の輸送体候補（LvH、SE、Core）と蛍光蛋白質mCherry（mCh）の融合輸送体蛋白質を発現する組換えメダカ作製を試みた結果、SE/mCh系統のみ継代できF2では100%の個体で組換えが確認された。一方、昨年度作出されたLvH/単量体アビジン(mSA)系統は、生残した親魚中に組換え個体がおらず継代ができなかった。２．上記tVGP/SE/mCh系統の仔魚・若年魚をエストロジェン暴露した結果、肝臓にて強い蛍光性が誘導された。同系統非暴露雌成魚では、肝臓に強い蛍光が確認された他、卵巣卵にも蛍光性が確認できた。卵巣卵では肝臓と比較し弱い蛍光性を示した。また、排卵後の卵では蛍光性が消失した。３．メダカ4種ビテロジェニン遺伝子のプロモーター領域および一部翻訳領域のcDNAクローニングに成功した。プロモーターアッセイとリアルタイム定量PCR測定を行った結果、VtgAa1タイプが最も発現優勢なサブタイプであり、次にVtgAbタイプであることが明らかになった。この結果は卵黄におけるVtgサブタイプ組成のLCMSMS解析でも同様の傾向を示した。以上の1-3の成果は、本研究の目標である融合輸送体の大量生産とその性状解析の基盤となり、今後の研究の進展が期待できる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason H31（R1）年度計画に挙げたすべての計画について、ほぼおおむね順調に進展している。一部予想と異なり、組換えが遺伝しなかった系統もあるが、組換え自体は可能であったため、今後件数を増やすことにより組換え魚の系統化ができると考える。tVGP/SE/mCh系統では、肝臓と卵巣での蛍光性が確認され、すでに本輸送システムのコンセプト証明に一定の成果が出ている。しかし、卵巣における蛍光性が若干弱いため、より輸送性の向上が期待できるtVGP/LvH/mCh系統作出も継続し、コンセプト証明の明確化を図る。また、排卵卵における蛍光性の消失が認められたが、卵巣卵の時点では蛍光性が確認されており、排卵に向けて卵内で蛍光蛋白質mCherryの分解が起こった可能性が高い。この時点で、輸送体の生化学性状解析を行うとともに、さらにmCherryから緑色蛍光蛋白質（GFP）に変更した系統を新規に作出することで、最終的かつ明確なコンセプト証明に導くことができると考える。
Strategy for Future Research Activity	１．組換え蛋白質生産性の更なる向上を期待し、メダカVGPの利用を開始する。その際、昨年度の試験成果により発現の優位性が示されたVtgAa1プロモーターをVGPとする系統の作出に着手する。２. tVGP/LvH/mCh及びtVGP/LvH/mSA系統の作出を継続し、卵への輸送体輸送を効率化することで本研究のコンセプトをより明確に実証する。３．GFPを蛍光体とすることで、排卵卵中の蛍光性維持を図り、卵からの輸送体精製とその生体内投与輸送試験に繋げる。