Effect of cyclophilin A in exosome produced by mammary epitheliocyte on bovine mastitis.

• Project/Area Number: 18H02326
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 42010:Animal production science-related
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 麻生 久 東北大学, 農学研究科, 教授 (50241625)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 北澤 春樹 東北大学, 農学研究科, 教授 (10204885) ; 奥 夏美 (岡田夏美) 東北大学, 農学研究科, 技術一般職員 (10621584) ; 野地 智法 東北大学, 農学研究科, 准教授 (10708001) ; 渡邊 康一 東北大学, 農学研究科, 助教 (80261494)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥17,550,000 (Direct Cost: ¥13,500,000、Indirect Cost: ¥4,050,000); Fiscal Year 2020: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000); Fiscal Year 2019: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000); Fiscal Year 2018: ¥7,410,000 (Direct Cost: ¥5,700,000、Indirect Cost: ¥1,710,000)
• Keywords: 牛乳房炎 / シクロフィリンＡ / エクソゾーム / 免疫反応 / 炎症 / ウシ乳房炎 / エクソソーム / マイクロアレー解析 / シクロフィリンA

Outline of Annual Research Achievements

シクロフィリンAは細胞外に放出され、炎症反応における白血球遊走因子ケモカインの一つであることが明らかとなり、乳腺上皮細胞からのエクソソーム依存的なシクロフィリンA分泌機構に加え、シクロフィリンAの樹状細胞によるT細胞調節機構に及ぼす作用を解明することは、シクロフィリンAを含めた白血球遊走因子を乳房炎治療の新たな標的分子とした治療法の開発に繋がり、抗生剤に頼らない乳房炎治療対策の新しい柱となると考えられる。今年度は、以下の研究成果を得た。
健康牛および乳房炎牛の乳からシクロフィリンAを含有したエクソソームを精製し、その粒径と含有されているシクロフィリンAの濃度の比較を行い、健康牛と乳房炎牛における乳汁中エクソソームの粒径と含有されているシクロフィリンAの濃度には違いが認められなかった。よって、ELISA法で検出しているシクロフィリンＡはエクソゾームに含有されない単体のシクロフィリンＡであることを明らかにした。
樹立に成功したウシ乳腺上皮細胞株を用いて、乳房炎を誘起させる菌体および菌体成分による炎症関連遺伝子の網羅的解析を行い、発現変動のあった免疫関連の14遺伝子をリストアップし、その発現をリアルタイムPCR法で解析した。マイクロアレイ解析により、発現変動のあった免疫関連の14遺伝子をリストアップすることができ、そのリアルタイムPCRによる検証を行い、リポ多糖LPS刺激により、IL-1α, IL-1β, IL-8, MCP-1(CCL2), CXCL2およびCXCL3の発現増強を検証することができたが、シクロフィリンA（PPIA）はいずれの刺激においても変動が見られなかったことより、異なる誘導系の存在が示唆された。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

シクロフィリンAは、乳腺上皮細胞からのエクソソーム依存的なシクロフィリンA分泌機構によって細胞外に放出されると考えられていた。本研究によって、乳汁中にはエクソゾームに含有されない単体のシクロフィリンＡが存在すること発見することができた。また、乳腺上皮細胞は菌体および菌体成分の刺激だけではシクロフィリンＡ遺伝子の発現が誘導されないことが判明し、他の誘導機構が存在することが明確となった。これにより、炎症誘起因子シクロフィリンＡは乳房炎発症に至る過程で重要な働きをしていることが明らかとなり、本研究の推進意義が明確となった。

Strategy for Future Research Activity

シクロフィリンAは細胞外に放出され、炎症反応における白血球遊走因子ケモカインの一つであることが明らかとなり、乳腺上皮細胞からのエクソソーム依存的なシクロフィリンA分泌機構に加え、シクロフィリンAの樹状細胞によるT細胞調節機構に及ぼす作用を解明することは、シクロフィリンAを含めた白血球遊走因子を乳房炎治療の新たな標的分子とした治療法の開発に繋がり、抗生剤に頼らない乳房炎治療対策の新しい柱となると考えられる。今年度は、以下の研究を行う。１）組換え型シクロフィリンＡを健康牛の乳頭孔より投与して乳汁中体細胞数の変動を解析して作用機構を明らかにする。また、シクロフィリンＡによる乳汁中への炎症因子の分泌誘導機構を解析する。 ２）樹立に成功したウシ乳腺上皮細胞株を用いて、健康牛の乳汁あるいは乳房炎牛の乳汁を処理し、シクロフィリンAおよび炎症誘起因子の産生機 構を解析する。また、炎症関連遺伝子の網羅的解析を行い、標的遺伝子についてリアルタイムRT-PCR法により検証する。最終的には、乳腺上皮細胞の乳房炎原因菌処理からアポトーシスに至る過程の形態的あるいは遺伝子的な変化を詳細に解析する。

Research Products

• [Journal Article] Efficient selection of new immunobiotic strains with antiviral effects in local and distal mucosal sites by using porcine intestinal epitheliocytes. (2020)
  • Author(s): Albarracin L, Garcia-Castillo V, Masumizu Y, Indo Y, Islam MA, Suda Y, Garcia-Cancino A, Aso H, Takahashi H, Kitazawa H, Villena J
  • Journal Title: Frontiers in Immunology Volume: 11 Pages: 1-16
  • DOI: 10.3389/fimmu.2020.00543
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Transcriptome Analysis of The Inflammatory Responses of Bovine Mammary Epithelial Cells: Exploring Immunomodulatory Target Genes for Bovine Mastitis (2020)
  • Author(s): Islam, Md. A., T. Michihiro, K. Fukuyama, H. Kitazawa et al.
  • Journal Title: Pathogens Volume: 9:200 Pages: 1-18
  • DOI: 10.3390/pathogens9030200
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Transcriptome modifications in the porcine intramuscular adipocytes during differentiation and exogenous stimulation with TNF-ホア and serotonin. (2020)
  • Author(s): Tada A, Islam MA, Kober HA, Fukuyama K, Takagi M, Igata M, Albarracin L, Ikeda-Ohtsubo W, Miyazawa K, Yoda K, He F, Takahashi H, Villena J, Aso H, Kitazawa H
  • Journal Title: International Journal of Molecular Sciences Volume: 21 Pages: 638-658
  • DOI: 10.3390/ijms21020638
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Organogermanium suppresses cell death due to oxidative stress in normal human dermal fibroblasts (2019)
  • Author(s): Tomoya Takeda, Sota Doiyama, Junya Azumi, Yasuhiro Shimada, Yoshihiko Tokuji, Hiroaki Yamaguchi, Kosuke Nagata, Naoya Sakamoto, Hisashi Aso, Takashi Nakamura
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 9 Pages: 13637-13637
  • DOI: 10.1038/s41598-019-49883-7
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] The Organogermanium Compound THGP Suppresses Melanin Synthesis via Complex Formation with L-DOPA on Mushroom Tyrosinase and in B16 4A5 Melanoma Cells (2019)
  • Author(s): Azumi Junya、Takeda Tomoya、Shimada Yasuhiro、Aso Hisashi、Nakamura Takashi
  • Journal Title: International Journal of Molecular Sciences Volume: 20 Pages: 4785-4797
  • DOI: 10.3390/ijms20194785
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Addition of Wakame seaweed ( Undaria pinnatifida ) stalk to animal feed enhances immune response and improves intestinal microflora in pigs (2019)
  • Author(s): Shimazu Tomoyuki、Borjigin Liushiqi、Katoh Kazuo、Roh Sang‐gun、Kitazawa Haruki、Abe Keietsu、Suda Yoshihito、Saito Hayato、Kunii Hiroshi、Nihei Ken、Uemoto Yoshinobu、Aso Hisashi、Suzuki Keiichi
  • Journal Title: Animal Science Journal Volume: 90 Pages: 1248-1260
  • DOI: 10.1111/asj.13274
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Isolation and Immunocharacterization of Lactobacillus salivarius from the Intestine of Wakame-Fed Pigs to Develop Novel “Immunosynbiotics” (2019)
  • Author(s): Masumizu, Y., B. Zhou, H. Kitazawa et al.
  • Journal Title: Microorganisms Volume: 7:167 Pages: 167-167
  • DOI: 10.3390/microorganisms7060167
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Transcriptome Modifications in Porcine Adipocytes via Toll-Like Receptors Activation (2019)
  • Author(s): Igata Manami、Islam Md. Aminul、Tada Asuka、Takagi Michihiro、Kober A. K. M. Humayun、Albarracin Leonardo、Aso Hisashi、Ikeda-Ohtsubo Wakako、Miyazawa Kenji、Yoda Kazutoyo、He Fang、Takahashi Hideki、Villena Julio、Kitazawa Haruki
  • Journal Title: Frontiers in Immunology Volume: 10 Pages: 1180-1194
  • DOI: 10.3389/fimmu.2019.01180
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Paraimmunobiotic Bifidobacteria Modulate the Expression Patterns of Peptidoglycan Recognition Proteins in Porcine Intestinal Epitheliocytes and Antigen Presenting Cells (2019)
  • Author(s): Iida, H., M. Tohno, Md. A. Islam, H. Kitazawa et al.
  • Journal Title: Cells Volume: 8:891 Pages: 1-22
  • DOI: 10.3390/cells8080891
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Staphylococcus aureus-specific IgA antibody in milk suppresses the multiplication of S. aureus in infected bovine udder (2019)
  • Author(s): Nagasawa Yuya、Kiku Yoshio、Sugawara Kazue、Hirose Aya、Kai Chiaki、Kitano Nana、Takahashi Toshihiko、Nochi Tomonori、Aso Hisashi、Sawada Shin-ichi、Akiyoshi Kazunari、Hayashi Tomohito
  • Journal Title: BMC Veterinary Research Volume: 15 Pages: 286-286
  • DOI: 10.1186/s12917-019-2025-3
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Genomic characterization of Lactobacillus delbrueckii TUA4408L and evaluation of the antiviral activities of its extracellular polysaccharides in porcine intestinal epithelial cells (2018)
  • Author(s): Kanmani, P., L. Albarracin, H. Kobayashi, E. M. Hebert, L. Saavedra, R. Komatsu, B. Gatica, A. S. Burgos, A. Miyazaki, W. Ikeda-Ohtsubo, Y. Suda, H. Aso, S. Egusa, T. Mishima, H. Takahashi, J. Villena, H. Kitazawa
  • Journal Title: Frontiers in Immunology Volume: 9:2178 Pages: 1-16
  • DOI: 10.3389/fimmu.2018.02178
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Development of immune and microbial environments is independently regulated in the mammary gland (2018)
  • Author(s): K. Niimi, K. Usami, Y. Fujita, M. Abe, M. Furukawa, Y. Suyama, Y. Sakai, M. Kamioka, N. Shibata, E.J. Park, S. Sato, H. Kiyono, H. Yoneyama, H. Kitazawa, K. Watanabe, T. Nochi and H. Aso
  • Journal Title: Mucosal Immunology Volume: 11 Pages: 643-653
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Phenotypic and functional analysis of bovine peripheral blood dendritic cells before parturition by a novel purification method. (2018)
  • Author(s): Zhuang T, Urakawa M, Sato H, Sato Y, Taguchi T, Umino T, Katto S, Tanaka K, Yoshimura K, Takada N, Kobayashi H, Ito M, Rose MT, Kiku Y, Nagasawa Y, Kitazawa H, Watanabe K, Nochi T, Hayashi T, Aso H
  • Journal Title: ANIMAL SCIENCE JOURNAL Volume: 89 Pages: 1011-1019
  • DOI: 10.1111/asj.13014
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Immunobiotics for the bovine host: their interaction with intestinal epithelial cells and their effect on antiviral immunity. (2018)
  • Author(s): Julio Villena, Hisashi Aso, Victor P. Rutten, Hideki Takahashi, Willem Van Eden and Haruki Kitazawa
  • Journal Title: Front. Immunol. Volume: 9 Pages: 1-10
  • DOI: 10.3389/fimmu.2018.00326
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Identification of a novel mechanism of action of bovine IgG antibodies specific for Staphylococcus aureus (2018)
  • Author(s): Furukawa Mutsumi、Yoneyama Hiroshi、Hata Eiji、Iwano Hidetomo、Higuchi Hidetoshi、Ando Tasuke、Sato Mika、Hayashi Tomohito、Kiku Yoshio、Nagasawa Yuya、Niimi Kanae、Usami Katsuki、Ito Kumiko、Watanabe Kouichi、Nochi Tomonori、Aso Hisashi
  • Journal Title: Vet. Res. Volume: 49 Pages: 22-22
  • DOI: 10.1186/s13567-018-0517-y
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 炎症誘起因子シクロフィリンA の乳房炎誘起能の発見 (2019)
  • Author(s): 遠藤佑真・佐藤佑子・小堤知之・浅野貴史・熊谷弘明・吉村 梢・庄 涛・浦川めぐみ・渡邊康一・野地智法・麻生 久
  • Organizer: 第126回日本畜産学会大会
• [Presentation] 離乳直後の腸内の免疫・微生物環境形成に及ぼすパイエル板の役割 (2019)
  • Author(s): 新實香奈枝・宇佐美克紀・古川睦実・馬場柚里・山内清哉・渡邊康一・麻生 久・野地 智法
  • Organizer: 第126回日本畜産学会大会
• [Presentation] 乳汁中のIgA抗体産生を促す腸内微生物の免疫・微生物学的意義 (2019)
  • Author(s): 宇佐美克紀、新實香奈枝、古川睦実、馬場柚里、内野紗江佳、山内清哉、渡邊康一、麻生 久、野地智法
  • Organizer: 第162回日本獣医学会学術集会
• [Presentation] 枯草菌を給与した初産牛は炎症状態に陥りにくく健康な状態を維持する (2019)
  • Author(s): 吉村 梢・浦川めぐみ・遠藤佑真・桂 哲平・浅野貴史・熊谷弘明。日野正浩・庄 涛・渡邊康一・野地智法・麻生 久
  • Organizer: 第69回東北畜産学会大会
• [Presentation] プロバイオティクス枯草菌による牛乳房炎発送予防効果 (2019)
  • Author(s): 麻生 久
  • Organizer: 第69回東北畜産学会大会
  • Invited
• [Presentation] Intestinal microflora changes during lactation and has relevance to the specificity of milk IgA and diversity of microflora in the mammary gland (2018)
  • Author(s): Niimi K, Usami K, Furukawa M, Sasaki S, Watanabe K, Aso H, Nochi T.
  • Organizer: Mucosal Immunology Course & Symposium (MICS2018), Oxford, UK
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] CCL28-mediated chemotaxis for the recruitment of IgA-producing plasma cells into the mammary gland depends on the lactation-related but not bacterial stimulus (2018)
  • Author(s): Nochi T, Niimi K, Usami K, Furukawa M, Sasaki S, Kiyono H, Watanabe K, Aso H.
  • Organizer: Mucosal Immunology Course & Symposium (MICS2018), Oxford, UK
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] シクロフィリンＡの乳頭投与が乳汁中体細胞数に与える影響 (2018)
  • Author(s): 佐藤佑子・吉村 梢・浦川めぐみ・庄 涛・田中孝太朗・遠藤佑真・伊藤 愛・小堤知行・小林宏子・高田直和・渡邊康一・野地智法・麻生 久
  • Organizer: 東北畜産学会第68回大会
• [Presentation] Effect of probiotic Bacillus Subtilis C-3102 strain on function of dendritic cells in bovine peripheral blood before and after parturition (2018)
  • Author(s): Zhuang T, Urakawa M, Sato H, Kobayashi H, Sato Y, Ashida N, Otomo N, Watanabe K, Nochi T, Aso H.
  • Organizer: The 30th World Buiatrics Congress, Sapporo, Japan
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Oral feeding with a probiotics Bacillus subtilis C-3102 modulates the immune and metabolic functions in dairy cattle, resulting in prevention of mastitis (2018)
  • Author(s): Urakawa M, Sato H, Zhuang T, Taguchi T, Katto S, Tanaka K, Kobayashi H, Ito M, Sato Y, Ashida N, Otomo N, Watanabe K, Nochi T, Aso H.
  • Organizer: The 30th World Buiatrics Congress, Sapporo, Japan
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ウシ乳房炎誘起因子シクロフィリンＡの乳汁における存在様式 (2018)
  • Author(s): 吉村 梢・海野 剛・浦川めぐみ・庄 涛・田中孝太朗・遠藤佑真・佐藤佑子・小堤知行・佐藤秀俊・渡邊康一・野地智法・麻生 久
  • Organizer: 日本獣医学会第161回大会
• [Presentation] パイエル板から乳腺に遊走するIgA産生細胞の同定 (2018)
  • Author(s): 宇佐美克紀・新實香奈枝・佐々木志保・馬場柚里・古川睦実・伊藤 駿・渡邊康一・麻生 久・野地智法
  • Organizer: 日本獣医学会第161回大会
• [Presentation] 早期診断法開発とプロバイオティクス飼料による乳房炎発症制御 (2018)
  • Author(s): 麻生 久
  • Organizer: 第49回日本家畜臨床学会
  • Invited
• [Book] 獣医組織学 第８版 (2020)
  • Author(s): 渡邊康一、麻生 久
  • Total Pages: 397
  • Publisher: 学窓社
  • ISBN: 9784873627731
• [Remarks] 東北大学大学院農学研究科 機能形態学分野
  • URL: http://www.agri.tohoku.ac.jp/keitai/index-j.html
• [Remarks] 東北大学大学院農学研究科 食と農免疫研究教育センター
  • URL: http://www.agri.tohoku.ac.jp/cfai/index.html
• [Remarks] 研究拠点形成事業 先端拠点形成
  • URL: http://www.agri.tohoku.ac.jp/fain/index.html
• [Remarks] 東北大学大学院農学研究科 機能形態学分野
  • URL: http://www.agri.tohoku.ac.jp/keitai/index-j.html
• [Remarks] 東北大学大学院農学研究科 食と農免疫研究教育センター
  • URL: http://www.agri.tohoku.ac.jp/cfai/index.html
• [Remarks] 研究拠点形成事業 先端拠点形成
  • URL: http://www.agri.tohoku.ac.jp/fain/index.html