In-vitro reconstitution of mitotic chromosomes
| Project/Area Number |
18H02381
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43010:Molecular biology-related
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
新冨 圭史 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (60462694)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2020)
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| Budget Amount *help |
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2020: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000)
Fiscal Year 2019: ¥5,850,000 (Direct Cost: ¥4,500,000、Indirect Cost: ¥1,350,000)
Fiscal Year 2018: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
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| Keywords | 染色体 / トポII / 再構成 / トポイソメラーゼⅡ / 分裂期 / トポイソメラーゼII / ヌクレオソーム / DNAトポロジー / コンデンシン / トポイソメラーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
「どのようにしてクロマチンは染色体へと折りたたまれるのだろうか？」この疑問を解くために、私は、カエルの精子核とわずか六種類の精製タンパク質（コンデンシンⅠ、トポイソメラーゼⅡ [トポⅡ]、コアヒストン、三種類のヒストンシャペロン）を用いて分裂期染色体様構造を試験管内に再構成するプロトコルを開発した。染色体構築に必要最低限のタンパク質が同定されたことよって、次の目標は、これらのタンパク質の協調的な働きによって生み出されるクロマチンの動作原理を理解することへとシフトした。
本計画では、上記の目標を着実に達成するために、再構成反応の条件最適化を行った。まず、トポⅡの染色体軸への集積が反応液中のイオン強度に依存することがわかった。さらに2019年度には、トポⅡ変異体を染色体再構成系に導入して、その染色体軸への集積の役割を検討した。まず、トポⅡのC末端領域を欠失させた変異体が染色体軸に局在できないこと見出した。興味深いことに、この変異体を加えた再構成実験では染色体の個別化は問題なく進行したが、最終的な染色体の形状は細く曲がりくねったものになった。また、環状DNAに対する酵素活性を評価したところ、C末端を欠いたトポⅡはDNA間に絡まりを導入する反応を触媒できないことがわかった。これらの結果から、トポⅡは、単一の染色体DNA内にある離れた領域間に絡まりを導入し、染色体軸の構造を安定化する可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請時には、「染色体再構成反応の洗練化」、「染色体軸ができるしくみの理解」。「ヌクレオソームの機能の理解」という具体的な目標を掲げた。現時点までに、最初の２つの目標に関して、いくつかの興味深い知見が得られいるため。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画のうち「ヌクレオソームが染色体構築に果たす役割」の理解は、思うように進んでいない。その要因のひとつは、従来の光学顕微鏡を用いた評価法では、正常な染色体とヒストンの変異体を用いて再構成した染色体の間にわずかな差異しか認められないことにある。この状況を打開するには、多面的かつ定量的に染色体構造を評価できる手法が求められる。そこで、計画を若干の変更を加え、（再構成系ではなく）カエル卵抽出液の無細胞系で作った染色体に対してHi-C（chromosome conformation capture）解析を行う。ゲノム情報解析を容易にするために、マウスの精子核をカエル卵抽出液中でインキュベートして染色体を作るプロトコルを採用する。この新しいプロトコルでは、卵由来のヒストンの供給を阻害することでヌクレオソームを含まない染色体様構造を作ることもできる。この唯一無二の特徴を活かし、ヌクレオソームを含まない染色体様構造に対してHi-C解析を行う。得られた配列解析データをもとにした高分子モデリングを行い、ヌクレオソームの有無の異なる染色体の間でDNAループの時空間ダイナミクスがどのように異なるのかを検討する。2020年度は計画の最終年度となるので、ここに述べた計画を通じて、次の科研費課題のたたき台となる予備データを収集したい。
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Report
(2 results)
Research Products
(10 results)
