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膜環境変化に伴う膜タンパク質の機能-ダイナミクス相関の解析

Research Project

Project/Area Number 18H02393
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Allocation TypeSingle-year Grants
Section一般
Review Section Basic Section 43020:Structural biochemistry-related
Research InstitutionYokohama City University

Principal Investigator

高橋 栄夫  横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (60265717)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 竹内 恒  国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究グループ長 (20581284)
Project Period (FY) 2018-04-01 – 2022-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2021)
Budget Amount *help
¥17,290,000 (Direct Cost: ¥13,300,000、Indirect Cost: ¥3,990,000)
Fiscal Year 2021: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
Fiscal Year 2020: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2019: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2018: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
KeywordsNMR / 膜タンパク質 / 酵素 / 界面活性剤 / 脂質
Outline of Annual Research Achievements

多様な膜環境下における膜タンパク質の機能-動的構造相関についての知見を得る目的で研究を進めている。大腸菌由来膜内プロテアーゼGlpGについて、昨年度まで活性評価の対象としていた可溶性カゼイン基質に対し、今年度は、本来の基質である膜貫通型基質を対象とした活性評価を行うため、その発現系の構築を行った。調製した三種(TatA、Gurken、HybA)の膜貫通型基質を用い、異なる界面活性剤環境中における基質切断活性を検討したところ、可溶性基質とは異なる界面活性剤依存性を示したうえに、基質の種類によっても切断活性が異なってくることが明らかとなった。この結果から、膜周辺環境の相違は膜タンパク質のみならず基質の構造状態も変え、切断活性に影響を与えると考えられた。今後は膜貫通型基質の構造状態に着目した解析も行っていく。
高分解能なNMRスペクトルを得る条件が確立できた好熱細菌由来光受容膜タンパク質については、三重ラベル(2H, 13C, 15N)試料を作製しNMRシグナル帰属を試みたが、その高い熱安定性から分子内部のD/H交換が不十分となり、分子全体のNMRシグナル帰属については完遂できなかった。試料調製プロトコルの大幅な改良を行った結果、最終的には高効率に水素交換した試料を調製することに成功し、現在NMRシグナル帰属実験・解析を実施中である。一方、多様な脂質二重膜環境におけるNMR解析を指向し、ナノディスクに内包した光受容体膜タンパク質試料の調製方法の検討、および溶液NMR解析を進めている。通常の精製法で調製した光受容体を用いた場合は分子凝集が顕著であったが、改良した精製プロトコルを採用することで想定されるサイズのナノディスクを調製することができた。今後多様な脂質二重膜系に内包された膜タンパク質試料として、その機能およびダイナミクスを解析できる見通しが立った。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

膜内プロテアーゼ活性の膜周辺環境との相関を解析するうえで、これまでその簡便さから可溶性カゼイン基質を使用していたが、真の活性評価という観点では、膜貫通型基質で評価を行うことが重要であり、今年度、その評価を行える膜貫通型基質発現系を構築し、活性評価ができるシステムを確立できた。
一方、高分解能NMRスペクトルが取得できている光受容膜タンパク質は、原子レベルでのNMR解析を行えることが期待できるものであるが、精緻なNMR解析を実施するためには、主鎖NMRシグナルの帰属が必要となる。帰属のための試料調製において必須となる重水素ラベル試料は調製できたものの、その高い熱安定性のためアミド水素のD/H交換が不十分であり、部分的なシグナル帰属しか進められなかった。そこで試料精製法を根底から見直し、リフォールディングを活用する方法を採用することで、水素交換を促進し、全シグナルが観測可能な試料を調製することに成功した。現在NMRシグナル帰属作業を実施中である。また、本研究においては、汎用的に用いられる界面活性剤中の構造解析だけでなく、様々な脂質二重膜中における膜タンパク質の機能・構造解析が重要となるが、それを可能とするバイセル、およびナノディスク調製が可能となってきた。
以上より、研究は概ね順調に進展していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

膜内プロテアーゼを対象とした構造解析においては、メチル基をプローブとしたNMR構造解析が主となる。現在、アミノ酸選択標識試料の調製、部位選択標識体によるNMRシグナル帰属を進めており、これまでに得られた機能的な知見をもとにしたNMR解析を実施する。また、膜環境の相違による膜貫通型基質の構造特性の相違についても注目すべきことが明らかとなったため、より詳細な機能解析、および確立した発現系を活用した基質のNMR構造解析も試みる。光受容膜タンパク質系については、現在進行中の主鎖シグナルの帰属を完了し、異なる膜様環境が、分子全体の構造・ダイナミクスに及ぼす影響を解明するためのNMR解析を実施する。

Report

(3 results)
  • 2020 Annual Research Report
  • 2019 Annual Research Report
  • 2018 Annual Research Report

Research Products

(30 results)

All 2021 2020 2019 2018

All Journal Article (11 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results,  Peer Reviewed: 11 results,  Open Access: 3 results) Presentation (19 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Invited: 3 results)

  • [Journal Article] Revisiting biomolecular NMR spectroscopy for promoting small-molecule drug discovery”2020

    • Author(s)
      Hiroyuki Hanzawa, Takashi Shimada, Mizuki Takahashi and Hideo Takahashi
    • Journal Title

      J. Biomol. NMR

      Volume: 74 Pages: 501-508

    • DOI

      10.1007/s10858-020-00314-0

    • Related Report
      2020 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Structural Fingerprints of an Intact Monoclonal Antibody Acquired under Formulated Storage Conditions via 15N Direct Detection Nuclear Magnetic Resonance2020

    • Author(s)
      Tokunaga Yuji、Takeuchi Koh、Okude Junya、Ori Kazutomo、Torizawa Takuya、Shimada Ichio
    • Journal Title

      J. Med. Chem.

      Volume: 63 Pages: 5360-5366

    • DOI

      10.1021/acs.jmedchem.0c00231

    • Related Report
      2020 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Targeting the cryptic sites: NMR-based strategy to improve protein druggability by controlling the conformational equilibrium2020

    • Author(s)
      Mizukoshi Yumiko、Takeuchi Koh、Tokunaga Yuji、Matsuo Hitomi、Imai Misaki、Fujisaki Miwa、Kamoshida Hajime、Takizawa Takeshi、Hanzawa Hiroyuki、Shimada Ichio
    • Journal Title

      Sci. Adv.

      Volume: 6

    • DOI

      10.1126/sciadv.abd0480

    • Related Report
      2020 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Cooperative interactions facilitate stimulation of Rad51 by the Swi5-Sfr1 auxiliary factor complex.2020

    • Author(s)
      Argunhan B, Sakakura M, Afshar N, Kurihara M, Ito K, Maki T, Kanamaru S, Murayama Y, Tsubouchi H, Takahashi M, Takahashi H, Iwasaki H.
    • Journal Title

      eLife

      Volume: 9

    • DOI

      10.7554/elife.52566

    • NAID

      120007117502

    • Related Report
      2019 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Structural mechanisms underlying activity changes in an AMPA-type glutamate receptor induced by substitutions in its ligand-binding domain2019

    • Author(s)
      Masayoshi Sakakura, Yumi Ohkubo, Hiraku Oshima, Suyong Re, Masahiro Ito, Yuji Sugita, and Hideo Takahashi
    • Journal Title

      Structure

      Volume: 27 Pages: 1698-1709

    • DOI

      10.1016/j.str.2019.09.004

    • Related Report
      2019 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Conformational equilibrium defines the variable induction of the multidrug-binding transcriptional repressor QacR2019

    • Author(s)
      Koh Takeuchi, Misaki Imai, and Ichio Shimada
    • Journal Title

      Proceedings of the National Academy of Sciences

      Volume: 116 Pages: 19963-19972

    • DOI

      10.1073/pnas.1906129116

    • Related Report
      2019 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Emerging solution NMR methods to illuminate the structural and dynamic properties of proteins2019

    • Author(s)
      Haribabu Arthanari, KohTakeuchi, Abhinav Dubey, and Gerhard Wagner
    • Journal Title

      Curr. Opin. Struct. Biol.

      Volume: 58 Pages: 294-304

    • DOI

      10.1016/j.sbi.2019.06.005

    • Related Report
      2019 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Population shift mechanism for partial agonism of AMPA receptor2019

    • Author(s)
      Oshima H, Re S, Sakakura M, Takahashi H, Sugita Y.
    • Journal Title

      Biophysical Journal

      Volume: 116 Pages: 52-68

    • DOI

      10.1016/j.bpj.2018.11.3122

    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Aromatic 19F-13C TROSY: a background-free approach to probe biomolecular structure, function, and dynamics2019

    • Author(s)
      Boeszoermenyi A, Chhabra S, Dubey A, Radeva D. L, Burdzhiev N. T, Chanev C. D, Petrov O. I, Gelev V. M, Zhang M, Anklin C, Kovacs H, Wagner G, Kuprov I, Takeuchi K, Arthanari H.
    • Journal Title

      Nat. Methods

      Volume: 16 Pages: 333-340

    • DOI

      10.1038/s41592-019-0334-x

    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Phosphoinositide binding by the PH domain in ceramide transfer protein (CERT) is inhibited by hyperphosphorylation of an adjacent serine-repeat motif2018

    • Author(s)
      Sugiki Toshihiko、Egawa Daichi、Kumagai Keigo、Kojima Chojiro、Fujiwara Toshimichi、Takeuchi Koh、Shimada Ichio、Hanada Kentaro、Takahashi Hideo
    • Journal Title

      J. Biol. Chem.

      Volume: 293 Pages: 11206-11217

    • DOI

      10.1074/jbc.ra118.002465

    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Methyl-selective isotope labeling using α-ketoisovalerate for the yeast Pichia pastoris recombinant protein expression system2018

    • Author(s)
      Suzuki Rika、Sakakura Masayoshi、Mori Masaki、Fujii Moe、Akashi Satoko、Takahashi Hideo
    • Journal Title

      J. Biomol. NMR

      Volume: 71 Pages: 213-223

    • DOI

      10.1007/s10858-018-0192-3

    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 神経栄養因子NGF高親和性受容体TrkAドメイン5と新規結合ペプチドの相互作用解析2021

    • Author(s)
      鈴木里佳、登坂綺水、浴本亨、髙橋真帆、山根努、坂倉正義、水越弓子、竹内恒、嶋田一夫、池口満徳、高橋栄夫
    • Organizer
      日本薬学会第140年会
    • Related Report
      2020 Annual Research Report
  • [Presentation] 脂質二重膜の多重層化に重要なミエリンタンパク質ゼロ細胞外ドメインのホモ相互作用メカニズムの解明2021

    • Author(s)
      坂倉正義、田辺幹雄、三尾和弘、高橋栄夫
    • Organizer
      日本薬学会第140年会
    • Related Report
      2020 Annual Research Report
  • [Presentation] 溶液NMRを用いた微生物型プロトンポンプロドプシンRxRの機能・構造解析2020

    • Author(s)
      廣畑雅史、鈴木里佳、小島慧一、吉田真帆子、村田武士、須藤雄気、高橋栄夫
    • Organizer
      第43回日本分子生物学会年会
    • Related Report
      2020 Annual Research Report
  • [Presentation] 脂質二重膜の重層化を担うミエリンタンパク質ゼロ細胞外ドメインのホモ相互作用メカニズムの解明2020

    • Author(s)
      坂倉正義、田辺幹雄、三尾和弘、高橋栄夫
    • Organizer
      第43回日本分子生物学会年会
    • Related Report
      2020 Annual Research Report
  • [Presentation] 溶液NMRを用いた動的構造創薬2020

    • Author(s)
      竹内恒
    • Organizer
      第93回日本生化学会大会
    • Related Report
      2020 Annual Research Report
  • [Presentation] 溶液NMRを用いた動的構造創薬2020

    • Author(s)
      竹内恒
    • Organizer
      2020年度 日本分光学会NMR分光部会
    • Related Report
      2020 Annual Research Report
  • [Presentation] NMR相互作用解析による創薬アプローチ2019

    • Author(s)
      高橋栄夫
    • Organizer
      生有研シンポジウム「生体分子間に働く相互作用解析法の現状と今後の可能性」
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      2019 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] 溶液NMR法を用いた界面活性剤ミセル中における膜タンパク質の比較構造解析2019

    • Author(s)
      里佳、吉田真帆子、廣畑雅史、村田武士、小島慧一、須藤雄気、高橋栄夫
    • Organizer
      第58回NMR討論会
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      2019 Annual Research Report
  • [Presentation] リコンビナーゼRad51と補助因子Swi5-Sfr1のNMR相互作用解析に向けた基盤研究2019

    • Author(s)
      井出優希、坂倉正義、真木孝尚、岩崎博史、高橋栄夫
    • Organizer
      第42回日本分子生物学会年会
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      2019 Annual Research Report
  • [Presentation] Rhomboid proteaseの様々な膜環境変化における酵素活性と熱安定性の評価2019

    • Author(s)
      薬袋勇樹、畠山彩由子、平島かれん、坂倉正義、高橋栄夫
    • Organizer
      第42回日本分子生物学会年会
    • Related Report
      2019 Annual Research Report
  • [Presentation] 異なる疑似膜環境中における耐熱性膜タンパク質RxRの構造安定性と機能の解析2019

    • Author(s)
      吉田真帆子、鈴木里佳、廣畑雅史、村田武士、小島慧一、須藤雄気、高橋栄夫
    • Organizer
      第42回日本分子生物学会年会
    • Related Report
      2019 Annual Research Report
  • [Presentation] Conformational equilibrium defines variable transcriptional repression of a multidrug binding transcriptional repressor, QacR2019

    • Author(s)
      Koh Takeuchi
    • Organizer
      8th Asia-Pacific NMR Symposium 2019
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      2019 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Targeting the cryptic sites: NMR-based strategy to improve the draggability of proteins by controlling the conformational equilibrium.2019

    • Author(s)
      Ko Takeuchi
    • Organizer
      第57回生物物理学会年会
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      2019 Annual Research Report
  • [Presentation] NMRを用いたAMPA型グルタミン酸受容体リガンド結合ドメインの運動性解析2018

    • Author(s)
      大久保優美、坂倉正義、横井誠矢、高橋栄夫
    • Organizer
      第41回日本分子生物学会年会
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
  • [Presentation] Rhomboid proteaseの活性メカニズム解明に向けた機能・構造解析2018

    • Author(s)
      畠山彩由子、薬袋勇樹、長倉玲音、坂倉正義、高橋栄夫
    • Organizer
      第41回日本分子生物学会年会
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
  • [Presentation] 末梢神経ミエリンの膜重層化に関与するタンパク質MPZと脂質との相互作用解析2018

    • Author(s)
      森雅樹、坂倉正義、三尾和弘、高橋栄夫
    • Organizer
      第41回日本分子生物学会年会
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
  • [Presentation] NMR analysis of the structural and functional stability of proteins2018

    • Author(s)
      Hideo Takahashi
    • Organizer
      The 6th International Symposium on Drug Discovery and Design by NMR
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] Methyl-selective 13C incorporation using alpha-ketoisovalerate for the yeast Pichia pastoris expression system2018

    • Author(s)
      Rika Suzuki, Masayoshi Sakakura, Hideo Takahashi
    • Organizer
      XXVIII International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] NMR を用いたアミロイド前駆蛋白質 C99 の構造解析2018

    • Author(s)
      坂倉正義、真嶋健大、三尾和弘、Charles Sanders、高橋栄夫
    • Organizer
      第18回日本蛋白質科学会年会
    • Related Report
      2018 Annual Research Report

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Published: 2018-04-23   Modified: 2021-12-27  

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