脂質からみたオートファジーの膜動態

Research Project

Project/Area Number	18H02399
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Allocation Type	Single-year Grants
Section	一般
Review Section	Basic Section 43030:Functional biochemistry-related
Research Institution	Tokyo Institute of Technology
Principal Investigator	堀江朋子 (川俣朋子) 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 助教 (70435527)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	中西広樹国立研究開発法人国立国際医療研究センター, 研究所, 脂質シグナリングプロジェクト特任研究員 (10466740) 佐々木雄彦東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 教授 (50333365)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2022-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2021)
Budget Amount *help	¥17,160,000 (Direct Cost: ¥13,200,000、Indirect Cost: ¥3,960,000) Fiscal Year 2021: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000) Fiscal Year 2020: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000) Fiscal Year 2019: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000) Fiscal Year 2018: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Keywords	オートファジー / 液胞/lysosome / 脂質分析 / リピドーム解析 / リパーゼ / 脂質分解 / 液胞/リソソーム / 脂質 / Atg15 / オートファジックボディ / 代謝
Outline of Annual Research Achievements	オートファジーは真核生物が持つ主要な分解システムである。オートファジーが誘導されると、細胞質に二重膜構造体のオートファゴソームが形成されるが、この膜を構成している膜脂質についての情報は殆ど無い。また、オートファゴソームは液胞/リソソーム内で内容物と共に分解されるが、膜脂質の分解についての分解機構も未だ不明である。これまでオートファジー関連膜の単離方法と微量なオルガネラの脂質解析技術が整備されていないかったことがその理由である。研究代表者はこれまで、オートファジー関連膜構造体の精製に成功しており、酵母においてオートファゴソームの内膜構造体であるオートファジックボディの単離精製法を確立させた。そこでオートファジー関連膜の組成についてリピドーム解析を駆使し、分子種レベルで明らかにすることを目的として実験を行っており、現在脂質組成の分析を行っている。また、液胞/リソソーム内での膜脂質分解について、液胞膜タンパク質であるAtg15に着目し、in vitroリパーゼアッセイ系を構築することで、液胞/リソソーム内での膜脂質の分解を理解することも、もう一つの研究テーマとして設定していた。 4年間の研究計画のうちの最初の2年間で、純度の高いオートファジー関連膜構造体の単離精製と、Atg15の単離という、いわば本研究の礎となる最も基本的な酵素と基質側の材料の調整法について、生化学的手法を駆使して行ってきた。また、Atg15の精製の過程でAtg15と共に共沈降してくるタンパク質の同定を、質量分析計を利用し行った。また、2年目においては、初年度での成果を発展させ、精製したオートファジックボディを膜を破壊し、オートファジー関連膜の膜成分のみを精製するという2段階精製法の確立に成功した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 初年度での成果を発展させ、精製したオートファジックボディを膜を破壊し、オートファジー関連膜の膜成分のみを精製するという純度の高い2段階精製法の確立に成功した。
Strategy for Future Research Activity	次年度は、精製した膜成分に含まれるタンパク質に着目する。これまでの電子顕微鏡観察によりオートファゴソーム膜はタンパク質がほとんど存在しない非常に独特な膜であることがわかっている。精製した膜成分に特異的に存在するタンパク質を同定できれば、オートファジーの優れたマーカータンパク質となることが期待されるため、質量分析によりタンパク質を同定し、局在解析とタンパク質欠損ではオートファジーにどのような影響がでるかを調べる。