Development of peptides inhibiting tumor angiogenesis and metastasis to develop a novel anti-cancer drug
| Project/Area Number |
18H02601
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 48030:Pharmacology-related
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
金保 安則 筑波大学, 医学医療系, 教授 (00214437)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
船越 祐司 筑波大学, 医学医療系, 助教 (30415286)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2020)
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| Budget Amount *help |
¥17,290,000 (Direct Cost: ¥13,300,000、Indirect Cost: ¥3,990,000)
Fiscal Year 2020: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2019: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000)
Fiscal Year 2018: ¥6,630,000 (Direct Cost: ¥5,100,000、Indirect Cost: ¥1,530,000)
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| Keywords | 抗がん剤 / 低分子量Gタンパク質 / シグナル伝達 / 浸潤・転移 / 腫瘍血管新生 / 抗癌剤 / ペプチド / Arf6 / 転移 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
低分子量G蛋白質Arf6は、腫瘍血管新生による腫瘍の増大と癌細胞の転移の両方において中心的な役割を果たしており、Arf6の阻害剤は効果的な抗癌剤となることが期待される。研究代表者らは、in vitroにおいてArf6に特異的に結合してArf6の活性を阻害する創薬リードペプチドを創成している。本研究では、本リードペプチドの腫瘍増殖と癌細胞転移に対する効果を検証するとともに、ペプチドを最適化し、腫瘍増殖と癌細胞転移を同時に阻害する革新的抗癌剤の開発を目指す。本年度は主に、１）細胞内において機能する膜透過性リードペプチドの作製、２）腫瘍増殖と癌細胞転移を細胞、個体レベルで評価する実験系の構築を実施した。
上記リードペプチドは、αヘリックス‐ループ‐αヘリクッス（HLHペプチド）構造をジスルフィド架橋により環状化したペプチドであるが、細胞内還元的な条件下でも開裂せずに安定なチオエーテル架橋を形成できるようペプチドを改変した。また、細胞膜透過性を高めるために6個のアルギニン残基を付加したリードペプチドを作製した。さらに、このペプチドの膜透過性を評価するために蛍光色素（テトラメチルローダミン）を付加する必要があり、そのための修飾を加えた。
２）については、細胞レベルでの評価系、個体レベルで腫瘍血管新生を評価する系はこれまでに構築しており、本年度はマウスにおいて癌細胞転移を評価する実験系を確立した。ルシフェラーゼを安定発現するヒト乳癌細胞株MDA-MB231細胞を尾静脈より投与し、肺への転移を解析したところ、Arf6の活性調節因子をノックダウンすることにより肺への転移が抑制されることを見出した。上記細胞膜透過性リードペプチドが完成次第、これら評価系を用いてリードペプチドの効果を検証する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ペプチドの合成については、アルギニン残基を付加したペプチドの合成が困難であったため、必要な合成量、純度を得るために合成条件を最適化しながら再合成を繰り返し、当初の計画より遅れていた。しかしながら、平成30年度までに必要なペプチド量・質を確保することができ、今年度はチオエーテル架橋による環状化、蛍光色素によるラベルを行うための改変を完了したことから、令和2年度早期に目的とする蛍光ラベルした膜透過性ペプチドを得ることができるものと予想される。この合成は、研究協力者の大阪府立大学大学院理学系研究科教授の藤井郁男が多くの実績を有しており、問題なく進められると考えられる。また、細胞膜透過性、血管新生と癌細胞の浸潤・転移の評価系は既に確立していることから、ペプチドの蛍光ラベルが完了次第、解析を実施できる状態にある。従って、本研究課題の遂行には問題ないと考えられる。
上記に加え、NMRによるリードペプチドとArf6の結合様式の解析を実施しており、これまでにおおよその結合領域を特定している。さらに詳細な構造決定のために、同位体標識したArf6蛋白質を高純度・高濃度にて精製することに成功しており、また重水素置換による構造決定も試みている。これらの解析は、NMRの解析に習熟した研究協力者の筑波大学教授・川口敦史とともに順調に進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、１）細胞膜透過性創薬リードペプチドの細胞内への取り込み評価、２）創薬リードペプチドの血管新生と癌細胞浸潤への効果を細胞レベルで解析、３）Arf6と創薬リードペプチドの結合様式の解明とリードペプチドの最適化、４）創薬ペプチドの腫瘍血管新生と癌細胞転移への効果をin vivoで評価、に取り組む予定である。
１）については、上記のとおりリードペプチドを蛍光ラベルし、細胞内への取り込み効率を蛍光顕微鏡観察にて定量、算出する。１）の結果と、ペプチドのArf6に対する結合活性（KD値：算出済み）や阻害活性（IC50）をもとに、２）の細胞レベルでの解析に必要な濃度を見積もり、リードペプチドが血管内皮細胞のチューブ形成、癌細胞の浸潤を阻害するのかを評価する。３）については、上述のように重水置換を行いNMRによる構造解析を行う。さらに、多次元NMR解析、分子動力学計算などから活性発現に重要な立体配座を決定し、最適なペプチドモデルを構築する。４）のin vivoにおける解析は、マウスをモデルとして令和2年度後半に実施する。マウスの皮下にB16メラノーマ細胞あるいはLewis lung carcinoma細胞を移植するとともに、創薬ペプチドを投与し、腫瘍の増大と腫瘍中の血管新生が阻害されるかを検証する。癌細胞の転移については、ルシフェラーゼを安定発現したMDA-MB231を乳腺に移植、または静脈より投与するとともに、創薬ペプチドを投与し、肺への転移を観察することにより、創薬ペプチドの有効性を評価する。
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Report
(2 results)
Research Products
(6 results)
