Regulatory mechanisms for signals on cell membrane and under microenvironment by complex of glycosphingolipids and membrane molecules

• Project/Area Number: 18H02628
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 49010:Pathological biochemistry-related
• Research Institution: Chubu University
• Principal Investigator: 古川 鋼一 中部大学, 生命健康科学部, 特任教授 (80211530)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大海 雄介 中部大学, 生命健康科学部, 助手 (10584758) ; 古川 圭子 中部大学, 生命健康科学部, 教授 (50260732)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥17,550,000 (Direct Cost: ¥13,500,000、Indirect Cost: ¥4,050,000); Fiscal Year 2020: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000); Fiscal Year 2019: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000); Fiscal Year 2018: ¥7,410,000 (Direct Cost: ¥5,700,000、Indirect Cost: ¥1,710,000)
• Keywords: スフィンゴ糖脂質 / 膜分子 / 複合体 / 微小環境 / シグナル / 脂質ラフト / 細胞外顆粒 / ミクロドメイン / クラスター / セラミド

Outline of Annual Research Achievements

細胞膜の脂質ラフトの構造、形成、機能等には不明の点が多い。そこで、スフィンゴ糖脂質糖鎖に固有のミクロドメイン(脂質ラフト) の時空間の動的形成過程と機能を解明し、その会合分子との複合体による膜環境の制御機構の解明を目指した。
1.スフィンゴ糖脂質の糖鎖固有のミクロドメイン形成と機能解明のため、メラノーマ等の細胞株に対して、EMARS/MS(enzyme-mediated activation of radical sources/mass spectrometry)法を用いて、ガングリオシドGD2に会合する膜分子を同定した。小細胞肺癌ではグルタミン輸送分子ASCT-2を、メラノーマ細胞においては、接着受容体であるインテグリンβ１を同定した。さらに、 小細胞肺癌細胞やメラノーマ細胞の膜上でGD2とASCT-2あるいはインテグリンが共局在し会合することを明らかにした。ASCT-2阻害剤による肺癌細胞の増殖抑制や、抗GD2抗体の添加によるメラノーマ細胞の増殖、接着の抑制が示された。
2. 脂質ドメインの化学構造に基づくスフィンゴ糖脂質-認識分子複合体形成の制御機構を解析した。即ち、糖脂質のセラミドの大部分が水酸化型である大腸癌細胞株を用いて、水酸化に働く酵素遺伝子、DES2及びFA2Hのノックアウトを行い、脂質修飾細胞株における糖脂質のラフト局在につき親株と比較検討した。水酸基除去細胞では、ガングリオシドGD3が脂質ラフトに局在することが判明した。
3. 細胞膜の脂質ラフトと細胞外顆粒との物理・化学的性状と機能連関の解析として、同定されている糖脂質会合膜分子の含量を検討し、GD3発現によるインテグリン含量の亢進を認めた。また、methyl -β-cyclodextrin 処理後の分泌顆粒の質/量の比較検討を行い、ラフト破壊細胞における著明な分泌顆粒の減少を明らかにした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

脂質ラフト形成の時空間の動的プロセスの解明を目指して、細胞膜上のミクロドメインで糖脂質と会合する膜分子の同定を試み、ほぼ順調に興味ふかい分子が同定され、さらに、癌形質における役割が具体的に明らかになりつつあることから、期待にそった結果と考えられる。また、脂質ラフトの形成における糖脂質の脂質部位、セラミドの役割に関しても、脂質修飾酵素の遺伝子ノックアウトにより、解りやすい結果が得られたことは、今後のさらなる展開が期待できる。

Strategy for Future Research Activity

まず、EMARS/MSのアプローチが順調に展開しそうなので、当初予定していた、①様々な糖鎖に対する抗体を用いて、糖脂質との会合分子を広範に同定していく。②種々の刺激直後の脂質ラフト形成の過程を分子集簇現象と捉え、分間隔でEMARS/MS解析を行うことで、各糖脂質の周囲にクラスター形成する分子プロファイルを解析する。③実験動物に形成した腫瘍組織の切片でEMARS/MS解析を行い、細胞実験の結果と比較する。
さらに、糖脂質のセラミド部位の修飾に関わる酵素遺伝子ノックアウト細胞株を用いて、①EMARS/MS解析による脂質ラフトの変異の全体像の解明、②大腸癌などの手術標本における糖脂質水酸化の制御とその腫瘍生物学的な意義を解明する。③これらの所見を、蛍光標識糖脂質と超高解像イメージングにより詳細に観察して、さらなる洞察を得る。
脂質ラフトの形成と構築が、細胞外分泌顆粒の形成、分泌にいかに反映されるかにつき、エクソソーム形成の初期段階における脂質ラフトの役割を検討する。さらに、エクソソーム上の分子複合体の性状の生化学的およびイメージング法による解析を行い、細胞外分泌小胞の形成と分泌における脂質ラフト並びにスフィンゴ糖脂質の役割を明らかにする。
これらの成果をふまえて、脂質ラフトの制御技術、細胞外分泌小胞の癌微小環境や癌転移における具体的な役割を、in vitro、in vivo の実験により明らかにすることで、その治療応用に繋げる予定である。

Research Products

• [Journal Article] Loss of enzyme activity of mutated B4GALNT1 gene products found in patients with hereditary spastic paraplegia induces relatively mild neurological disorders: Similarity with phenotypes of B4galnt1 knockout mice. (2019)
  • Author(s): Robiul H. Bhuiyan, Yuhsuke Ohmi, Yuki Ohkawa, Pu Zhang, Maiko Takano, Noboru Hashimoto, Tetsuya Okajima, Keiko Furukawa, Koichi Furukawa
  • Journal Title: Neuroscienc Volume: 397 Pages: 94-106
  • DOI: 10.1016/j.neuroscience.2018.11.034
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Anti-GD2 CAR T cells could prove transformative for H3-K27M+ diffuse midline gliomas (2019)
  • Author(s): Koichi Furukawa, Yuhsuke Ohmi, Keiko Furukawa
  • Journal Title: Translational Cancer Research Volume: 8(2) Pages: 87-93
  • DOI: 10.21037/tcr.2018.08.21
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] New era of research on cancer-associated glycosphingolipids. (2019)
  • Author(s): Koichi Furukawa, Yuhsuke Ohmi, Yuki Ohkawa, Robiul H. Bhuiyan, Pu Zhang, Orie Tajima, Noboru Hashimoto, Kazunori Hamamura, Keiko Furukawa
  • Journal Title: Cancer Science Volume: 110 Pages: 1544-1551
  • DOI: 10.1111/cas.14005
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Roles of GalNAc-disialyl Lactotetraosyl Antigens in Renal Cancer Cells. (2018)
  • Author(s): Tsuchida A, Senda M, Ito A, Saito S, Kiso M, Ando T, Harduin-Lepers A, Matsuda A, Furukawa K, Furukawa K.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 8 Pages: 1-15
  • DOI: 10.1038/s41598-018-25521-6
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Enhancement of malignant properties of human glioma cells by ganglioside GD3/GD2. (2018)
  • Author(s): Taiji Iwasawa, Pu Zhang, Yuki Ohkawa, Hiroyuki Momota, Toshihiko Wakabayashi, Yuhsuke Ohmi, Robiul H. Bhuiyan, Keiko Furukawa, Koichi Furukawa
  • Journal Title: Int J Oncol. Volume: 52 Pages: 1255-1266
  • DOI: 10.3892/ijo.2018.4266
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ASC amino acid transporter 2, defined by enzyme-mediated activation of radical sources, enhances malignancy of GD2-positive small-cell lung cancer. (2018)
  • Author(s): Nobutoshi Esaki, Yuki Ohkawa, Noboru Hashimoto, Yuhsuke Tsuda, Yuhsuke Ohmi, Robiul H. Bhuiyan, Norihiro Kotani, Koichi Honke, Atsushi Enomoto, Masahide Takahashi, Keiko Furukawa, Koichi Furukawa.
  • Journal Title: Cancer Scienc Volume: 109 Pages: 141-153
  • DOI: 10.1111/cas.13448
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Lactosylceramide synthase, encoded by β4-galactosylteransferase-5 and -6, is pivotal for neuronal generation and myelin formation in mice (2018)
  • Author(s): Toru Yoshihara, Hiroyuki Satake, Toshikazu Nishie, Nozomu Okino, Toshihisa Hatta, Hiroki Otani, Hiroshi Suzuki, Kazushi Sugihara, Eikichi Kamimura, Noriyo Tokuda, Keiko Furukawa, Koichi Fururkawa, Makoto Ito, and Masahide Asano
  • Journal Title: Plos Genetics Volume: 14
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Gangliosides in inflammation and neurodegeneration. (2018)
  • Author(s): Furukawa K, Ohmi Y, Tajima O, Ohkawa Y, Kondo Y, Shuting J, Hashimoto N, Furukawa K
  • Journal Title: Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. Volume: 156 Pages: 265-287
  • DOI: 10.1016/bs.pmbts.2018.01.009
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Site-1 protease deficiency causes human skeletal dysplasia due to defective inter-organelle protein trafficking (2018)
  • Author(s): Kondo, Y., Fu, J., Wang, H., Hoover, C., McDaniel, M., Steet, R., Patra, D., Song, J., Pollard, J., Cathey, S., Yago, T., Wiley, G., Macwana, S., Guthridge, J., McGee, S., Li, S., Griffin, C., Furukawa, K., James, J.A., Ruan, C., McEver, R.P., Wierenga, K., Gaffney, P., Xia, L.
  • Journal Title: J Clin Invest Insight Volume: 3
  • DOI: 10.1172/jci.insight.121596
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Genome-wide CRISPR screens for Shiga toxins and Ricin reveal Golgi proteins critical for glycosylation. (2018)
  • Author(s): Songhai Tian, Khaja Muneeruddin, Mei Yuk Choi, Liang Tao, Robiul H. Bhuiyan, Yuhsuke Ohmi, Keiko Furukawa, Koichi Furukawa, Sebastian Boland, Scott A. Shaffer, Rosalyn M. Adams, Min Dong
  • Journal Title: PLoS Biol. Volume: 16(11) Pages: 1-31
  • DOI: 10.1371/journal.pbio.2006951
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Differential roles of gangliosides in malignant properties of melanomas. (2018)
  • Author(s): Ohmi Y, Kambe M, Ohkawa Y, Hamamura K, Tajima O, Takeuchi R, Furukawa K, Furukawa K
  • Journal Title: PLOS One Volume: 13(11)
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0206881
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Ig上のシアル酸機能の解析とSALSA法によるマウス脳組織のシアル化糖鎖構造解析 (2018)
  • Author(s): 大海 雄介, 古川 鋼一
  • Organizer: 第37回 日本糖質学会年会
  • Invited
• [Presentation] 糖鎖改変に伴う肝脂肪蓄積抑制の分子メカニズム (2018)
  • Author(s): 田島 織絵, 古川 圭子, 古川 鋼一
  • Organizer: 第91回日本生化学会大会
• [Presentation] 癌関連スフィンゴ糖脂質による細胞動態の分別的制御に関するタイムラプス解析 (2018)
  • Author(s): 古川 圭子, 神戸 真理子, 大海 雄介, 大川 祐樹, 竹内 理香, 田島 織絵, 安藤 弘宗, 古川 鋼一
  • Organizer: 第91回日本生化学会大会
• [Presentation] 癌転移におけるエクソソームの役割の解析 (2018)
  • Author(s): 児玉 佳輝, 章 青, 大海 雄介, Hasan Bhuiyan Robiul, Yesmin Farhana, 山本 聡子, 古川 圭子, 古川 鋼一
  • Organizer: 第91回日本生化学会大会
• [Presentation] グリオーマーの微小環境調節におけるガングリオシドGD3の役割 (2018)
  • Author(s): 張 璞, 大川 祐樹, 大海 雄介, Robiul H.Bhuiyan, 加藤 彰, 古川 圭子, 岡島 徹也, 若林 俊彦, 古川 鋼一
  • Organizer: 第77回 日本癌学会学術総会
• [Presentation] 癌関連ガングリオシド合成酵素遺伝子の発現制御機構シグナルの解析：シグナル伝達阻害剤による検討 (2018)
  • Author(s): 竹内 理香, 宮田麻衣子, ウプル ジャヤデワン, 田島 織絵, 神戸 真理子, 古川 鋼一, 古川 圭子
  • Organizer: 第77回 日本癌学会学術総会
• [Presentation] 糖鎖リモデリング癌細胞由来エキソソームの膜分子組成と分泌機構の解析 (2018)
  • Author(s): 小林 伊織, 大海 雄介, 古川 圭子, ブイヤン ロビウル, 張 璞, 古川 鋼一
  • Organizer: 第77回 日本癌学会学術総会
• [Presentation] Roles of asialo-series ganglioside GD1alpha in human cancer cell lines (2018)
  • Author(s): Robiul H.Bhuiyan, Yuji Kondo, Yuki Ohkawa, Yuhsuke Ohmi, Pu Zhand, Tetsuya Okajima, Keiko Furukawa, Koichi Furukawa
  • Organizer: 第77回 日本癌学会学術総会