| Project/Area Number |
18H02974
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 57020:Oral pathobiological science-related
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| Research Institution | Matsumoto Dental University |
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Principal Investigator |
吉田 明弘 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (20364151)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
阪本 泰光 岩手医科大学, 薬学部, 准教授 (00349036)
吉成 伸夫 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (20231699)
三好 智博 松本歯科大学, 歯学部, 講師 (60534550)
宇田川 信之 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (70245801)
高橋 晋平 松本歯科大学, 歯学部, 助手 (20805014)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2020)
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| Budget Amount *help |
¥17,290,000 (Direct Cost: ¥13,300,000、Indirect Cost: ¥3,990,000)
Fiscal Year 2020: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2019: ¥5,330,000 (Direct Cost: ¥4,100,000、Indirect Cost: ¥1,230,000)
Fiscal Year 2018: ¥7,410,000 (Direct Cost: ¥5,700,000、Indirect Cost: ¥1,710,000)
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| Keywords | ロイコトキシン / LFA-1 / 侵襲性歯周炎 / ワクチン / A. actinomycetemcomitans |
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| Outline of Annual Research Achievements |
侵襲性歯周炎の原因菌であるAggregatibacter actinomycetemcomitansが産生する外毒素ロイコトキシン(LtxA)は侵襲性歯周炎の発症に関与する。本研究では、LtxAのCD14陽性細胞上の受容体LFA-1との結合部位を正確に決定し、LtxAの結合部位に対する中和抗体を誘導するワクチンの作成を目的とする。本ワクチンは外毒素を標的としているので、従来の歯周病ワクチンの問題点であるバイオフィルムによる抗体の送達阻害の影響も受けない。本ワクチンにより誘導された抗体がLtxAとCD14陽性細胞の結合を阻害することにより、侵襲性歯周炎における組織傷害を防ぐことが期待できる。
本研究においては、LtxAがCD14陽性細胞上に発現するLFA-1と結合することが明らかになっているので、LtxAのコンポーネントワクチンによる中和抗体の誘導を目標にワクチンのデザインを行う。
LtxA結合領域を含むタンパク質断片とレンチウイルス発現ベクターを用いて培養細胞に発現させたリコンビナントCD11a, CD18分子の結合を解析した。LtxAの結合領域と推定されるリピート領域と培養細胞に発現させたリコンビナントCD11a, CD18分子の結合の解析を試みたが、CD18分子が細胞表面への発現がみられず、解析不能であった。そこで、精製CD11a, CD18分子とLtxAとの結合について表面プラズモン共鳴分析装置Biacoreを用いて解析したところ、CD11a, CD18各分子とはそれぞれ結合が見られなかった。そこで、CD11a, CD18を混在させた状態で結合を解析したところ、LtxAとの結合が確認された。このことから、LtxAが結合する受容体形成において、CD11a, CD18の両者によって形成される受容体配列が重要であることが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
LtxAを標的としたワクチン開発にあたり、①免疫源の選択、②モデル動物の作成、③アジュバントの選択、④投与方法および誘導抗体の選択、の4つのポイントに分けて研究を進めた。
当初予定していたLtxAタンパク質の結晶化をJAXAの協力の下に行ったが、成功しなかった。LtxAは1056アミノ残基からなる分子量116 kDaの巨大分子であり、タンパク質全体を結晶化するのが難しいため、更に結合領域と推定されるリピート領域のみの組換えタンパク質の作製を試みたが、成功しなかった。そこで、LtxAは分割せず、LtxAとレンチウイルス発現ベクターを用いて培養細胞に発現させたリコンビナントCD11a, CD18分子の結合を解析した。LtxAの結合領域と推定されるリピート領域と培養細胞に発現させたリコンビナントCD11a, CD18分子の結合の解析を試みたが、CD18分子が細胞表面への発現がみられず、解析不能であった。そこで、精製CD11a, CD18分子とLtxAとの結合について表面プラズモン共鳴分析装置Biacoreを用いて解析したところ、CD11a, CD18各分子とはそれぞれ結合が見られなかった。そこで、CD11a, CD18を混在させた状態で結合を解析したところ、LtxAとの結合が確認された。このことから、LtxAが結合する受容体形成において、CD11a, CD18の両者によって形成される受容体配列が重要であることが明らかになった。本結果は申請者らが初めて発見したもので、本結果の発見によりワクチン作製の戦略も大きく変わってくることから、ワクチン開発の上で非常に重要な知見である。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究から、LtxAのLFA-1(CD11a, CD18のヘテロダイマー)への結合にはCD11a, CD18の両者が必要であり、これらのネイティブな立体構造により形成される受容体配列が必須であることが明らかになった。今後、LtxAの阻害タンパク質を作製し、LtxAのLFA-1への阻害効果をBiacoreを用いた解析を行うことにより、LtxAのLFA-1への正確な結合領域を推定する。さらに、推定される結合領域について、LtxAの阻害ペプチド質を作製し、LtxAのLFA-1(CD11a, CD18のヘテロダイマー)への阻害効果についてBiacoreを用いて同様に解析することによりLtxAのLFA-1への結合領域を解明する。阻害を誘導できるペプチドがLtxAのコンポーネントワクチンになる。
次に、得られたワクチンをウサギに接種し、得られた血清抗体を用いてLtxAのLFA-1への結合阻害効果を検証し、本ペプチドのワクチンとしての有用性を検証する。
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