Development of vibration-driven DNA amplification system performing at a speed per second and a temperature of 37 degrees
| Project/Area Number |
18H03524
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
|
| Allocation Type | Single-year Grants |
|---|
| Section | 一般 |
|---|
| Review Section |
Basic Section 90110:Biomedical engineering-related
|
|---|
| Research Institution | Kanagawa University |
|---|
Principal Investigator |
山口 栄雄 神奈川大学, 工学部, 教授 (20343634)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
米田 征司 神奈川大学, 工学部, 准教授 (40343636)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2020)
|
| Budget Amount *help |
¥17,810,000 (Direct Cost: ¥13,700,000、Indirect Cost: ¥4,110,000)
Fiscal Year 2020: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
Fiscal Year 2019: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
Fiscal Year 2018: ¥11,050,000 (Direct Cost: ¥8,500,000、Indirect Cost: ¥2,550,000)
|
|---|
| Keywords | DNA / 核酸 / 振動 / 増幅 / PCR / ポリメラーゼ / 秒速 / 恒温 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
一般には、DNAを増幅させるには、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）法が用いられるが、この手法では、通常、ｉ）94℃：熱変性、ii）54℃：アニーリング、iii）72℃：伸長の3種の温度間で熱サイクルを実施する。とくに、DNAを変性（二本鎖から一本鎖に解離）させるために、94℃という高温加熱を必須としている点が問題となっている。具体的には、a）高温下で、多数回の熱サイクルによりDNAの損傷や酵素の失活が生じ、b）熱サイクル自体も、理想的な矩形波ではなく、裾を引き、実際にはかなり歪んだサイクルを実施している。その結果、本来のターゲット以外に余分な増幅部分（非特異性）や断片由来のスメアが生じることで、DNA解析の結果に不正確さが引き起こされる。
本研究では、DNA水溶液の入ったプラスチックチューブ全体を100～500Hzの可聴周波数で高速に振動させることにより、DNA増幅を1分以内かつ37℃恒温下で実施可能な新技術を開発することを目的としている。従来の熱サイクルPCR法で用いられている高温加熱によるDNAの熱変性に替わり、申請者が見出した振動によるDNAの変性技術を500bpサイズのDNAでまず実施し、アニーリング・伸長反応と併せて1サイクルとする新しいDNA増幅を部分的に実現した。
増幅進行温度は、37℃という生細胞が生存し得る温度での恒温条件で実施し、使用した振動源は、自作によるコイルを用いた振動子であるが、振幅は、電圧一定であっても、周波数依存性があるため、レーザー変位計により、振動子の変位を実測し、依存性を構成した。1サイクル当たりの増幅度は、最大1.7となった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
チューブ内のDNA溶液の構成は、酵素、バッファ、ｄNTP等の混合液を用いた。また、自作の振動子の改良を行い、滑らかに振動を実現することで、増幅の再現性を高めることに成功した。振動させたDNA溶液をアガロースゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、およびリアルタイムPCR法にかけ、全ての測定においてDNAの増幅が確認できた。アガロース電気泳動では、SYBRGreenⅠおよびⅡによる蛍光強度によりDNAの振動変性の条件を予め調べた上、増幅実験を実施した。
最も増幅した条件は、電圧5V、振動10s、無振動30s、5サイクルでの1.7倍であった。なお、このときにDNAに加えられたエネルギーは2.45×10-7[J]であった。
|
| Strategy for Future Research Activity |
これまで使用する酵素は、37℃で至適活性を有する大腸菌由来のKlenow Fragmentであったが、特性的に振動に弱いという弱点を有する。そこで、酵素の安定性と活性のバランスを取るため、[Mg2+]をキレートするEDTA（エチレンジアミン四酢酸）を調整したバッファを使用する。また、振動によるDNAのダメージと塩基配列のズレで生じる効率の低下を補償するため、細胞中でDNA修復に用いられている校正機能である、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を持つBSM酵素をKlenowと混合することでDNA増幅の効率を高める。
以上の組み合わせにより、より忠実な増幅かつ秒速でのDNA増幅法を目標とする。DNA増幅法では、二本鎖から一本鎖への解離を利用するが、視点を変えれば、DNAを不安定にする効果が必要であることを意味する。このため、外部条件である振動によりDNAを不安定化することはもちろん、内部条件である緩衝液等の溶液構成により不安定性を適度に導く配合を探ることが不可欠である。
|
Report
(1 results)
Research Products
(4 results)
