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化学アプローチによる膜蛋白質の動的解析

Research Project

Project/Area Number 18H03935
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (A)

Allocation TypeSingle-year Grants
Section一般
Review Section Medium-sized Section 37:Biomolecular chemistry and related fields
Research InstitutionOsaka University

Principal Investigator

菊地 和也  大阪大学, 工学研究科, 教授 (70292951)

Project Period (FY) 2018-04-01 – 2021-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2020)
Budget Amount *help
¥44,330,000 (Direct Cost: ¥34,100,000、Indirect Cost: ¥10,230,000)
Fiscal Year 2020: ¥13,650,000 (Direct Cost: ¥10,500,000、Indirect Cost: ¥3,150,000)
Fiscal Year 2019: ¥14,560,000 (Direct Cost: ¥11,200,000、Indirect Cost: ¥3,360,000)
Fiscal Year 2018: ¥16,120,000 (Direct Cost: ¥12,400,000、Indirect Cost: ¥3,720,000)
Keywords蛋白質ラベル化 / 化学プローブ / GLUT4 / TLR4 / 膜蛋白質 / PYPタグ / BLタグ / 1分子イメージング / タンパク質ラベル化
Outline of Annual Research Achievements

PYPタグラベル化法を用いたGLUT4の機能解析として、細胞膜上に移行したGLUT4を選択的・迅速・高コントラストに可視化するために、膜非透過性で、遊離状態の蛍光が抑制されラベル化されると蛍光強度が強くなる発蛍光プローブの開発を行った。特にマウスを用いた実験への応用を考慮し、近赤外蛍光を示す蛍光色素として、650~700 nmに蛍光発光波長を有するSiローダミン系の色素を選択した。これらの色素にPYPタグリガンド、消光基を導入することで発蛍光プローブを合成した。SDS-PAGE解析により発蛍光プローブのラベル化を確認した。さらに蛍光スペクトル測定により、ラベル化速度、及び発蛍光性を評価したところ、ラベル化が迅速に起こり、大きく蛍光強度が上昇することが明らかとなった。
もう一つの成果として、変異体ベータラクタマーゼ(BL)タグシステムを用いた膜蛋白質の蛍光ラベル化による解析を目的としたラベル化プローブの開発を行った。BLタグに対するより高いラベル化効率と保持能、光耐性を確保するために、BLタグのリガンド部位として、 これまでのベータラクタムからなる基質に加え、ベータラクタマーゼ阻害剤の化学構造を導入したプローブを新たに設計・合成した。近年報告された阻害剤に由来する骨格を有する化学プローブを合成した。ラベル化能を評価したところ、BLタグを迅速にラベル化し、長時間インキュベート後も安定にプローブが保持されていることを確認した。また、このプローブは野生型のベータラクタマーゼをタグとした場合も標的蛋白質を効率よくラベル化できることを確認することができた。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度の目的である、膜蛋白質をラベル化する新たな蛍光プローブの開発は達成しており、順調に進展しているといえる。また、BLタグを利用したラベル化に関しては、新たなリガンド構造を有するプローブを開発し、優れたラベル可能と保持性能を示すことを明らかにすることができた。

Strategy for Future Research Activity

PYPタグラベル化法を用いたGLUT4の機能解析においては、細胞膜上に移行したGLUT4の膜局在維持機構を解明するため、GLUT4にラベル化した近傍の分子を捉える新たなプローブを開発する。このプローブは、細胞膜非透過性の蛍光性PYPタグリガンドとビオチンからなっており、PYP-GLUT4を発現させた細胞に対しプローブのラベル化後、市販のクロスリンク剤で処理を行い、蛋白質同士を架橋させる。膜蛋白質を可溶化し、ビオチン-ストレプトアビジンの相互作用を利用してGLUT4が結合した分子を特異的に濃縮する。得られた蛋白質をSDS-PAGEにより解析し比較する。Trypsin消化後にMS/MS解析を行い、標的蛋白質を同定する。
BLタグを用いた膜蛋白質動態の解析においては、新たに開発したプローブを用い、細胞外の脂質ラフトに局在が見られるGPIアンカーの付いた膜蛋白質をラベル化し、イメージングを行う。また、細胞膜内葉の膜蛋白質をラベルするためには、プローブが細胞膜を透過する必要がある。現状のプローブでは膜透過性を有していないため、細胞内で分解可能なエステル構造を導入するなどの改変を加える。この改変されたプローブを用いて免疫系の膜蛋白質であるToll様受容体4(TLR4)とアダプター蛋白質(TIRAP)をそれぞれ近赤外と赤色で染め分けてラベル化、解析できるかどうかを検証する。

Report

(2 results)
  • 2019 Annual Research Report
  • 2018 Annual Research Report

Research Products

(18 results)

All 2020 2019 2018

All Journal Article (9 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Peer Reviewed: 9 results,  Open Access: 2 results) Presentation (9 results) (of which Int'l Joint Research: 8 results,  Invited: 9 results)

  • [Journal Article] Development of Fluorogenic Probes for Rapid High-Contrast Imaging of Transient Nuclear Localization of Sirtuin 32020

    • Author(s)
      Gao J, Hori Y, Shimomura T, Bordy M, Hasserodt J, Kikuchi K
    • Journal Title

      ChemBioChem

      Volume: 21 Pages: 656-662

    • DOI

      10.1002/cbic.201900568

    • Related Report
      2019 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Live-Cell Imaging of Protein Degradation Utilizing Designed Protein-Tag Mutant and Fluorescent Probe with Turn-Off Switch2020

    • Author(s)
      Gao J, Hori Y, Takeuchi O, Kikuchi K
    • Journal Title

      Bioconjugate Chemistry

      Volume: 31 Pages: 577-583

    • DOI

      10.1021/acs.bioconjchem.9b00696

    • Related Report
      2019 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Photolytic Release of a Caged Inhibitor of an Endogenous Transcription Factor Enables Optochemical Control of CREB-Mediated Gene Expression2020

    • Author(s)
      Imoto Takuma、Kawase Akihiro、Minoshima Masafumi、Yokoyama Tatsushi、Bito Haruhiko、Kikuchi Kazuya
    • Journal Title

      Org Lett.

      Volume: 22 Pages: 22-25

    • DOI

      10.1021/acs.orglett.9b03568

    • Related Report
      2019 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] In Vivo Multicolor Imaging with Fluorescent Probes Revealed the Dynamics and Function of Osteoclast Proton Pumps2019

    • Author(s)
      Minoshima Masafumi、Kikuta Junichi、Omori Yuta、Seno Shigeto、Suehara Riko、Maeda Hiroki、Matsuda Hideo、Ishii Masaru、Kikuchi Kazuya
    • Journal Title

      ACS Cent Sci.

      Volume: 5 Pages: 1059-1066

    • DOI

      10.1021/acscentsci.9b00220

    • Related Report
      2019 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] SCOTfluors: Small, Conjugatable, Orthogonal, and Tunable Fluorophores for In Vivo Imaging of Cell Metabolism2019

    • Author(s)
      Benson Sam、Fernandez Antonio、Barth Nicole D.、de Moliner Fabio、Horrocks Mathew H.、Herrington C. Simon、Abad Jose Luis、Delgado Antonio、Kelly Lisa、Chang Ziyuan、Feng Yi、Nishiura Miyako、Hori Yuichiro、Kikuchi Kazuya、Vendrell Marc
    • Journal Title

      Angewandte Chemie International Edition

      Volume: 58 Pages: 6911-6915

    • DOI

      10.1002/anie.201900465

    • Related Report
      2019 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Highly Sensitive Detection of Caspase-3/7 Activity in Living Mice Using Enzyme-Responsive 19F MRI Nanoprobes2018

    • Author(s)
      Akazawa Kazuki、Sugihara Fuminori、Nakamura Tatsuya、Mizukami Shin、Kikuchi Kazuya
    • Journal Title

      Bioconjugate Chemistry

      Volume: 29 Pages: 1720-1728

    • DOI

      10.1021/acs.bioconjchem.8b00167

    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Sensing caspase-1 activity using activatable 19F MRI nanoprobes with improved turn-on kinetics2018

    • Author(s)
      Akazawa Kazuki、Sugihara Fuminori、Minoshima Masafumi、Mizukami Shin、Kikuchi Kazuya
    • Journal Title

      Chemical Communications

      Volume: 54 Pages: 11785-11788

    • DOI

      10.1039/c8cc05381b

    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Perfluorocarbon‐Based 19F MRI Nanoprobes for In Vivo Multicolor Imaging2018

    • Author(s)
      Akazawa Kazuki、Sugihara Fuminori、Nakamura Tatsuya、Matsushita Hisashi、Mukai Hiroaki、Akimoto Rena、Minoshima Masafumi、Mizukami Shin、Kikuchi Kazuya
    • Journal Title

      Angewandte Chemie International Edition

      Volume: 57 Pages: 16742-16747

    • DOI

      10.1002/anie.201810363

    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Synthetic-Molecule/Protein Hybrid Probe with Fluorogenic Switch for Live-Cell Imaging of DNA Methylation2018

    • Author(s)
      Yuichiro Hori, Norimichi Otomura, Ayuko Nishida, Miyako Nishiura, Maho Umeno, Isao Suetake, Kazuya Kikuchi
    • Journal Title

      Journal of the American Chemical Society

      Volume: 140 Pages: 1686-1690

    • DOI

      10.1021/jacs.7b09713

    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] New Biological Findings which were Revealed by Designed Fluorescent Probes2019

    • Author(s)
      Kikuchi Kazuya
    • Organizer
      Chemical Biology & Physiology Conference 2019
    • Related Report
      2019 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] In vivo Multicolor Imaging with Fluorescent Probes Revealed Dynamics and Function of Osteoclast Proton Pumps2019

    • Author(s)
      Kikuchi Kazuya
    • Organizer
      16th International, Methods & Applications of Fluorescence (Roger Y Tsien Memorial Symposium)
    • Related Report
      2019 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] In vivo Chemical Probes for MRI and Fluorescence Imaging2019

    • Author(s)
      Kikuchi Kazuya
    • Organizer
      ICBIC-19, International Conference on Biological Inorganic Chemistry
    • Related Report
      2019 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Development of Multifunctional 19F MRI Contrast Agents Based on Fluorine-encapsulated Silica Nanoparticle2019

    • Author(s)
      Kikuchi Kazuya
    • Organizer
      The Future of Molecular MR: A Cellular and Molecular Imaging Workshop
    • Related Report
      2019 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] イメージングプローブのデザイン・合成によるケミカルバイオロジー研究2019

    • Author(s)
      菊地 和也
    • Organizer
      第19回日本蛋白質科学会年会 第71回日本細胞生物学会大会 合同年次学会
    • Related Report
      2019 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] New Biological Findings Which Were Revealed by Designed Chemical Probes2018

    • Author(s)
      Kikuchi Kazuya
    • Organizer
      A3 Meeting for Chemical Biology
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] In Vivo Chemical Probes for MRI and Fluorescence Imaging2018

    • Author(s)
      Kikuchi Kazuya
    • Organizer
      The 9th Asian Biological Inorganic Chemistry Conference (AsBIC IX)
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Development of Multifunctional 19F MRI Contrast Agents Based on Fluorine-encapsulated Silica Nanoparticle2018

    • Author(s)
      Kikuchi Kazuya
    • Organizer
      Imaging in 2020
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] New Biological Findings Which Were Clarified by Designed Chemical Probes2018

    • Author(s)
      Kikuchi Kazuya
    • Organizer
      MSMLG 2018, 6th International Conference on Molecular Sensors and Molecular Logic Gates
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research / Invited

URL: 

Published: 2018-04-23   Modified: 2021-01-27  

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