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Application of natural antibodies from cartilaginous fish

Research Project

Project/Area Number 18H03958
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (A)

Allocation TypeSingle-year Grants
Section一般
Review Section Medium-sized Section 40:Forestry and forest products science, applied aquatic science, and related fields
Research InstitutionTokyo University of Marine Science and Technology

Principal Investigator

近藤 秀裕  東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (20314635)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 廣野 育生  東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (00270926)
羽生 義郎  国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (20357792)
筒井 繁行  北里大学, 海洋生命科学部, 准教授 (20406911)
矢澤 良輔  東京海洋大学, 学術研究院, 准教授 (70625863)
Project Period (FY) 2018-04-01 – 2022-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2021)
Budget Amount *help
¥44,460,000 (Direct Cost: ¥34,200,000、Indirect Cost: ¥10,260,000)
Fiscal Year 2021: ¥8,970,000 (Direct Cost: ¥6,900,000、Indirect Cost: ¥2,070,000)
Fiscal Year 2020: ¥8,970,000 (Direct Cost: ¥6,900,000、Indirect Cost: ¥2,070,000)
Fiscal Year 2019: ¥8,970,000 (Direct Cost: ¥6,900,000、Indirect Cost: ¥2,070,000)
Fiscal Year 2018: ¥17,550,000 (Direct Cost: ¥13,500,000、Indirect Cost: ¥4,050,000)
Keywords魚介類免疫 / バイオテクノロジー
Outline of Annual Research Achievements

本年度はドチザメおよびチョウザメを対象に、各魚種由来の抗体の抗原親和性およびエピトープを解析することを目的として、抗体遺伝子を用いたファージディスプレイプレイライブラリーを構築し、バイオパニング法によるスクリーニングを試みた。しかしながら、いずれも顕著な結合を示すクローンを得るには至らなかった。一方、ドチザメを組み換えウイルス抗原で免疫したものの、顕著な抗体価の上昇は見られなかったが、チョウザメをウシIgGで免疫したところ、免疫一月後に顕著な抗体価の上昇が確認された。
また、ドチザメについて抗体産生組織を解析する目的で、次世代シークエンサーを用いたトランスクリプトームデータを精査したところ、本魚種では肝臓で抗体産生が顕著であることが示された。さらに肝臓では、抗体重鎖遺伝子と高いアミノ酸同一率を示すものの、多様性領域にあたる配列に組み換えに関わるVDJ配列を持たないユニークな分子が発現していることを見いだした。さらに肝臓では、他の脊椎動物と同様にリゾチームなどの抗菌タンパク質の産生も盛んであった。しかしながら、ドチザメ血清中のタンパク質は50%以上がIgMであり、肝臓由来のタンパク質の割合は少なかった。
本年度はさらにヒラメを用い、サイトカインが抗体産生に及ぼす影響を調べるため、種々の病原微生物分子パターン(PAMPs)としてペプチドグリカンおよびpolyICを用い、組換えタンパク質抗原とPAMPsを組み合わせて投与した場合の抗体価の変化を解析した。組換えタンパク質抗原に対する抗体価は、本タンパク質のみを投与した場合と比べてペプチドグリカンを混合投与した場合に高くなり、polyICを混合投与した場合に低くなった。polyICを投与した区でのみI型インターフェロン遺伝子の遺伝子発現が見られたことから、本サイトカインの抗体産生に及ぼす効果について興味が持たれた。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでの試験では、ドチザメについては、自然抗体が病原微生物を認識するもののタンパク質抗原に対する結合はあまり見られず、病原微生物に対する結合も直接的に比較できないもののチョウザメのものよりも低い傾向にあった。さらにドチザメについては免疫により抗原特異的な抗体が産生されることはなかった。一方、チョウザメは自然抗体が病原微生物を含む様々な分子を認識するが、ウシIgGを用いて免疫した試験において非免疫魚では抗原に対する抗体はみられず、免疫によってのみ抗原に対する抗体価が上昇することが示された。さらに、これらの魚種由来血清は病原微生物を凝集させることはなかったことから、これらの血中抗体を直接魚病対策に用いることは難しいことが示唆された。
本年度は昨年に引き続き、ファージディスプレイ法を用いた解析を行ったものの、抗原特異的に反応するドチザメおよびチョウザメ由来の抗体遺伝子を単離するには至っていない。したがって、これらの魚種がもつ自然抗体は免疫に寄らず様々な抗原を認識するものの、その結合様式を明らかにするには至っていない。しかしながら本研究により、これらの魚種がもつ抗体分子が他の硬骨魚の抗体と共通の構造を持つことが示された。
本研究により、ドチザメは肝臓において多量の抗体を産生していることが示された。軟骨魚類と同様に血中タンパク質に対する抗体の割合が高いチョウザメにおいても、肝臓での抗体遺伝子の発現が見られる。肝臓は血中のタンパク質を多量に産生する臓器であることから、これらの魚種において肝臓は抗体産生の重要な役割を担う可能性が示唆された。
さらに本研究では、硬骨魚の抗体産生に及ぼす環境およびサイトカインの影響を明らかとした。これらの成果は、進化の過程で魚類の抗体産生がどのように変化してきたかを調べる上で重要な知見である。

Strategy for Future Research Activity

ドチザメについては、自然抗体が様々な病原微生物を認識するものの、その結合力はそれほど高くないと考えられる。また、ドチザメ血中のIgMには5量体と単量体があるものの、これらが病原微生物の認識にどのように関わるのかについては不明である。一方、チョウザメの自然抗体はタンパク質抗原を含め様々な分子や病原微生物を認識するものの、認識できない分子があることも明らかとなりつつある。このようなタンパク質レベルでの血中IgMの詳細な性状解析を進める必要がある。
一方、チョウザメについてはこれまで自然抗体に着目して研究を進めてきたが、他の硬骨魚と同様に免疫によって抗体価が上昇することが明らかとなったことから、他の硬骨魚の抗体も含め、ドチザメで得られた血中抗体分子の基礎的知見と比較した際の違いについて、特にタンパク質レベルでの解析を進めていく。とくにこれまで軟骨魚類およびチョウザメの血中IgMを解析する課程で、これらが異なる数の単量体からなるいくつかの多量体を構成することが示されている。このような多量体構造と抗原結合性についていくつかの魚種で比較していく。
またドチザメでは肝臓が抗体産生における重要な器官である可能性が示された。ドチザメ肝臓の抗体産生における役割を明らかとするため、組織切片観察を含めた解析を行うとともに、肝臓の進化的な機能の変化について明らかとすることで、広く魚類の血中タンパク質産生がどのように変わってきたかを明らかとしたい。
さらに、硬骨魚を用いた研究では、環境やPAMPsなどの免疫賦活剤が抗体産生に及ぼす影響を解析してきたが、これらが特異抗体および自然抗体の産生にそれぞれどのように関与するかを明らかとすることで、抗体の魚類生体防御における重要性についてさらに詳しい知見を得ることが求められる。

Report

(3 results)
  • 2020 Annual Research Report
  • 2019 Annual Research Report
  • 2018 Annual Research Report

Research Products

(20 results)

All 2021 2020 2019 2018

All Journal Article (6 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Presentation (14 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results)

  • [Journal Article] Characterization of natural antigen-specific antibodies from na?ve sturgeon serum2020

    • Author(s)
      Yasumoto Kyutaro、Koiwai Keiichiro、Hiraoka Kiyoshi、Hirono Ikuo、Kondo Hidehiro
    • Journal Title

      Developmental & Comparative Immunology

      Volume: 112 Pages: 103770-103770

    • DOI

      10.1016/j.dci.2020.103770

    • Related Report
      2020 Annual Research Report
  • [Journal Article] Screening Antibody Libraries with Colony Assay Using scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Proteins2020

    • Author(s)
      Hanyu Yoshiro、Kato Mieko
    • Journal Title

      Molecules

      Volume: 25 Pages: 2905-2905

    • DOI

      10.3390/molecules25122905

    • Related Report
      2020 Annual Research Report
  • [Journal Article] Potentiating Antigen-Specific Antibody Production with Peptides Obtained from In Silico Screening for High-Affinity against MHC-II2019

    • Author(s)
      Hanyu Yoshiro、Komeiji Yuto、Kato Mieko
    • Journal Title

      Molecules

      Volume: 24 Pages: 2949-2949

    • DOI

      10.3390/molecules24162949

    • Related Report
      2019 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Adjuvant effects on protection and immune response of Japanese flounder immunized by the formalin-killed cells of Edwardsiella tarda2019

    • Author(s)
      Kondo Hidehiro、Chung Seangmin、Hirosawa Eriko、Hirono Ikuo
    • Journal Title

      Fish & Shellfish Immunology

      Volume: 84 Pages: 120-123

    • DOI

      10.1016/j.fsi.2018.09.071

    • Related Report
      2018 Annual Research Report
  • [Journal Article] Identification and expression analysis of Fc receptor-like proteins in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)2019

    • Author(s)
      Jirapongpairoj Walissara、Hirono Ikuo、Kondo Hidehiro
    • Journal Title

      Fish & Shellfish Immunology

      Volume: 87 Pages: 82-86

    • DOI

      10.1016/j.fsi.2019.01.002

    • Related Report
      2018 Annual Research Report
  • [Journal Article] Single-step colony assay with autoinduction of scFv expression for the screening of antibody libraries2019

    • Author(s)
      Kato Mieko、Hanyu Yoshiro
    • Journal Title

      BioTechniques

      Volume: 66 Pages: 194-197

    • DOI

      10.2144/btn-2018-0195

    • Related Report
      2018 Annual Research Report
  • [Presentation] 複数魚種由来のIgMを認識する人工抗体の作出2021

    • Author(s)
      近藤秀裕・Walissara Jirapongpairoj・野崎玲子・廣野育生(海洋大)
    • Organizer
      令和3年度日本水産学会春季大会
    • Related Report
      2020 Annual Research Report
  • [Presentation] ドチザメ Triakis scyllium リゾチームの性状解析2021

    • Author(s)
      室谷冬香・矢澤良輔・廣野育生・近藤秀裕(海洋大)
    • Organizer
      令和3年度日本水産学会春季大会
    • Related Report
      2020 Annual Research Report
  • [Presentation] ヒラメエドワジエラ症に対するペプチドグリカンおよびpolyICのアジュバント効果の検討2021

    • Author(s)
      菊本辰善(海洋大)・吉井啓亮・村瀬直哉・山田英俊・福田穣(大分水研)・野崎玲子・廣野育生・近藤秀裕(海洋大)
    • Organizer
      令和3年度日本魚病学会春季大会
    • Related Report
      2020 Annual Research Report
  • [Presentation] コイの高温飼育が抗体産生に及ぼす影響2020

    • Author(s)
      佐藤哲平 ・廣野育生・近藤秀裕
    • Organizer
      令和2年度日本魚病学会春季大会
    • Related Report
      2019 Annual Research Report
  • [Presentation] Neobenedenia girellaeに対するワクチン抗原遺伝子探索のための発達段階別トランスクリプトーム解析2020

    • Author(s)
      田邉勇樹・川戸智・野崎玲子・白樫正・近藤秀裕・廣野育生
    • Organizer
      令和2年度日本魚病学会春季大会
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      2019 Annual Research Report
  • [Presentation] Edwardsiella tarda DNAのアジュバント効果の検討2020

    • Author(s)
      菊本辰善・野崎玲子・廣野育生・近藤秀裕
    • Organizer
      令和2年度日本魚病学会春季大会
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      2019 Annual Research Report
  • [Presentation] 軟骨魚類自然抗体の抗原結合能に及ぼす生息地域の影響2020

    • Author(s)
      藤村拓実・室谷冬香・野崎玲子・矢澤良輔・長沢貴宏・杣本智軌・中尾実樹・廣野育生・近藤秀裕
    • Organizer
      令和2年度日本水産学会春季大会
    • Related Report
      2019 Annual Research Report
  • [Presentation] ドチザメIg産生器官における網羅的遺伝子解析2020

    • Author(s)
      室谷冬香・矢澤良輔・廣野育生・近藤秀裕
    • Organizer
      令和2年度日本水産学会春季大会
    • Related Report
      2019 Annual Research Report
  • [Presentation] Edwardsiella tarda 由来 DNA で刺激した HINAE 細胞における網羅的遺伝子発現解析2018

    • Author(s)
      廣澤英里子・小祝敬一郎・野崎玲子・廣野育生・近藤秀裕
    • Organizer
      平成30年度日本魚病学会秋季大会
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
  • [Presentation] チョウザメ由来ナイーブ抗体の応用に向けた抗体遺伝子の配列解析2018

    • Author(s)
      近藤 秀裕・安本 玖太郎・小祝 敬一郎・平岡 潔・廣野 育生
    • Organizer
      第70回日本生物工学会大会
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      2018 Annual Research Report
  • [Presentation] BINDING OF FC RECEPTOR-LIKE PROTEINS TO IGM AND BACTERIA IN JAPANESE FLOUNDER (PARALICHTHYS OLIVACEUS)2018

    • Author(s)
      Walissara Jirapongpairoj, Ikuo Hirono, Hidehiro Kondo
    • Organizer
      International Society for Developmental and Comparative Immunity 2018
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Purification and characterization of antigen-specific antibodies from naive sturgen serum2018

    • Author(s)
      Kyutaro Yasumoto, Keiichiro Koiwai, Kiyoshi Hiraoka, Ikuo Hirono, Hidehiro kondo
    • Organizer
      International Society for Developmental and Comparative Immunity 2018
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      2018 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Interferon gamma expression responses by PAPMs and Freund's complete adjuvant injection in Japanese flounder2018

    • Author(s)
      Eriko Hirosawa, Hidemasa Kawakami, Ikuo Hirono, Hidehiro Kondo
    • Organizer
      International Society for Developmental and Comparative Immunity 2018
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      2018 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 非免疫チョウザメ末梢血白血球からの抗原特異 B 細胞の単離2018

    • Author(s)
      安本 玖太郎・小祝 敬一郎・千葉 隆史・鈴木 宏明・平岡 潔・廣野 育生・近藤 秀裕
    • Organizer
      第20回マリンバイオテクノロジー学会
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      2018 Annual Research Report

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Published: 2018-04-23   Modified: 2021-12-27  

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