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New development of genome editing technologies and disease models

Research Project

Project/Area Number 18H03974
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (A)

Allocation TypeSingle-year Grants
Section一般
Review Section Medium-sized Section 42:Veterinary medical science, animal science, and related fields
Research InstitutionThe University of Tokyo (2019-2021)
Osaka University (2018)

Principal Investigator

真下 知士  東京大学, 医科学研究所, 教授 (80397554)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 吉見 一人  東京大学, 医科学研究所, 講師 (50709813)
鈴木 啓一郎  大阪大学, 基礎工学研究科, 教授 (70433654)
中田 慎一郎  大阪大学, 医学系研究科, 特命教授 (70548528)
Project Period (FY) 2018-04-01 – 2022-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2021)
Budget Amount *help
¥43,810,000 (Direct Cost: ¥33,700,000、Indirect Cost: ¥10,110,000)
Fiscal Year 2021: ¥12,870,000 (Direct Cost: ¥9,900,000、Indirect Cost: ¥2,970,000)
Fiscal Year 2020: ¥12,870,000 (Direct Cost: ¥9,900,000、Indirect Cost: ¥2,970,000)
Fiscal Year 2019: ¥8,580,000 (Direct Cost: ¥6,600,000、Indirect Cost: ¥1,980,000)
Fiscal Year 2018: ¥9,490,000 (Direct Cost: ¥7,300,000、Indirect Cost: ¥2,190,000)
Keywordsゲノム編集 / CRISPR-Cas / 培養細胞 / 受精卵 / オフターゲット / 診断薬 / CRISPR-Cas3 / 疾患モデル / DNA修復 / CRISPR/Cas / マウス受精卵
Outline of Annual Research Achievements

CRISPR-Cas9を利用することで培養細胞やモデル動物において効率的に遺伝子改変ができるようになったが、未だオフターゲット変異などの安全性や特許紛争などの課題がある。本研究では、新規ゲノム編集技術CRISPR-Cas3を用いることで、哺乳動物培養細胞および実験動物受精卵での効率的なゲノム編集法を確立することが目的である。さらに、このゲノム編集技術CRISPR-Cas3によるDNA切断、およびDNA修復メカニズムを解明することで、ゲノム編集の効率化およびオフターゲット変異の評価等を行う。最後に、確立した新規ゲノム編集技術CRISPR-Cas3を利用して、ヒト遺伝性疾患のex vivo治療、in vivo治療モデルを開発する。本研究により、新しいヒト疾患モデル動物の開発、および新たなゲノム編集治療における革新的基盤技術の開発を目指している。
これまでの研究成果は、論文として取りまとめて投稿している。関連する研究内容を査読付き英文論文12編、国内図書7編に取りまとめた。Cas3タンパク質を製造する方法(特願2021-31907)について、特許出願を行った。その他、招待講演として国際2回、国内7回の講演を行った。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

新規ゲノム編集技術CRISPR-Cas3による哺乳動物細胞および受精卵におけるゲノム編集法の確立、およびゲノム編集動物の作製、治療モデルの開発を目的として、以下の研究を実施した。
① CRISPR-Cas3タンパク質によるDNA切断:大腸菌CRISPR-Cas3システムからタンパク質を精製して、試験管内でのDNA切断を確認した。Cas3の特異的な二本鎖DNA切断の際に、非特異的な一本鎖DNA切断が起こることを発見し、CONANと名付けた。この新しい核酸検出技術を用いて、新型コロナなど新興感染症に対する迅速診断薬の開発を行っている。
② ヒト培養細胞におけるゲノム編集:ヒト培養細胞において、CRISPR-Cas3によるゲノム編集を実施した。大腸菌CRISPR-Cas3システムから精製した高品質タンパク質を利用することでヒト細胞において高効率ゲノム編集に成功した。
③ CRISPR-Cas3システムによるゲノム編集メカニズムの解明、オフターゲット評価:Cas3タンパク質による in vitroゲノム編集を実施して、CRISPR-Cas3システムによるゲノム編集メカニズムの一端を解明した。高速原子力顕微鏡AFMによるDNA二本鎖切断の可視化に成功した。
④ CRISPR/Cas3システムによるゲノム編集モデル動物の作成:CRISPR-Cas3システムをマウス受精卵にマイクロインジェクションにより導入して、マウスTyr遺伝子ノックアウトに成功した。
以上のことから、平成30年度、令和1、2年度開始当初の研究計画に一部の変更はあったものの、おおむね順調に進展していると自己評価する。

Strategy for Future Research Activity

CRISPR-Cas3による哺乳動物細胞および受精卵におけるゲノム編集法の確立、およびゲノム編集動物の作製、治療モデルの開発を目的として、令和3年度は引き続き、以下の研究を実施する。
① CRISPR-Cas3による核酸検出法:令和1年度に発見したCRISPR-Cas3による非特異的一本鎖DNA切断技術を用いて、新型コロナ変異型やインフレエンザなど新興感染症に対する迅速診断薬の開発を継続する。
② ヒト細胞におけるゲノム編集: 大腸菌CRISPR-Cas3システムから精製した高品質タンパク質を利用して、さらなるヒト細胞における高効率ゲノム編集を実施し、オフターゲット解析による安全性の向上を検討する。
③ CRISPR-Cas3システムによるゲノム編集メカニズムの解明:Cas3タンパク質によるゲノム編集、高速原子力顕微鏡AFMによるDNA二本鎖切断の可視化、DNA修復因子の同定等を行うことで、CRISPR-Cas3によるDNA二本鎖切断およびDNA修復メカニズムを解明する。
④ CRISPR/Cas3システムによるゲノム編集モデル動物の作成:CRISPR-Cas3によるヒト疾患モデル動物の開発を実施する。CRISPR-Cas3発現マウスにおけるin vivoゲノム編集治療モデルの開発を検討する。

Report

(3 results)
  • 2020 Annual Research Report
  • 2019 Annual Research Report
  • 2018 Annual Research Report

Research Products

(79 results)

All 2021 2020 2019 2018 Other

All Journal Article (34 results) (of which Int'l Joint Research: 6 results,  Peer Reviewed: 23 results,  Open Access: 14 results) Presentation (40 results) (of which Int'l Joint Research: 5 results,  Invited: 40 results) Book (1 results) Remarks (2 results) Patent(Industrial Property Rights) (2 results)

  • [Journal Article] Genetic deletion of the 67-kDa isoform of glutamate decarboxylase alters conditioned fear behavior in rats.2021

    • Author(s)
      Fujihara K, Sato T, Miyasaka Y, Mashimo T, Yanagawa Y.
    • Journal Title

      FEBS Open Bio.

      Volume: 11 Pages: 340-353

    • DOI

      10.1002/2211-5463.13065

    • Description
      in press
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    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] PHF24 is expressed in the inhibitory interneurons in rats2021

    • Author(s)
      Numakura Yuki、Uemura Risa、Tanaka Miyuu、Izawa Takeshi、Yamate Jyoji、Kuramoto Takashi、Kaneko Takehito、Mashimo Tomoji、Yamamoto Takashi、Serikawa Tadao、Kuwamura Mitsuru
    • Journal Title

      Exp. Anim.

      Volume: 70 Issue: 1 Pages: 137-143

    • DOI

      10.1538/expanim.20-0105

    • NAID

      130007981760

    • ISSN
      0007-5124, 1341-1357, 1881-7122
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  • [Journal Article] Digenic mutations in ALDH2 and ADH5 impair formaldehyde clearance and cause a multisystem disorder, AMeD syndrome2020

    • Author(s)
      Oka Y, Hamada M, Nakazawa Y, ..., Tanaka M, Suganami T, Nakada S, Mitsutake N, Hara Y, Kato K, ..., Kaneko H, Matsumoto N, Matsuda F, Matsuo K, Takahashi Y, Mashimo T, Kojima S, Ogi T
    • Journal Title

      Science Advances

      Volume: 6 Pages: 7197-7197

    • DOI

      10.1126/sciadv.abd7197

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    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] CRISPR/Cas9-engineered Gadl elimination in rats leads to complex behavioral changes : implications for schizophrenia.2020

    • Author(s)
      Fujihara K, Yamada K, Ichitani Y, Kakizaki T, Suto T, Watanabe M, Kajita Y, Ohshiro T, Mushiake H, Miyasaka Y, Mashimo T, Yasuda H, Yanagawa Y.
    • Journal Title

      Transl Psychiatry.

      Volume: 10 Pages: 1-13

    • DOI

      10.1038/s41398-020-01108-6

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  • [Journal Article] Down syndrome cell adhesion molecule like-1 (DSCAML1) links the GABA system and seizure susceptibility.2020

    • Author(s)
      Hayase Y, Amano S, Hashizume K, Tominaga T, Miyamoto H, Kanno Y, Ueno-Inoue Y, Inoue T, Yamada M, Ogata S, Balan S, Hayashi K, Miura Y, Tokudome K, Ohno Y, Nishijo T, Momiyama T, Yanagawa Y, Takizawa A, Mashimo T, Serikawa T, Sekine A, Nakagawa E, Takeshita E, Yoshikawa T, Waga C, Inoue K, Goto YI, Nabeshima Y, et al.
    • Journal Title

      Acta Neuropatholgica Communications

      Volume: 8 Pages: 1-17

    • DOI

      10.1186/s40478-020-01082-6

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    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Photoactivatable Cre knock-in mice for spatiotemporal control of genetic engineering in vivo2020

    • Author(s)
      Yoshimi Kazuto、Yamauchi Yuko、Tanaka Takao、Shimada Toshio、Sato Moritoshi、Mashimo Tomoji
    • Journal Title

      Laboratory Investigation

      Volume: 101 Pages: 125-135

    • DOI

      10.1038/s41374-020-00482-5

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  • [Journal Article] Aspects of Gene Therapy Products Using Current Genome-Editing Technology in Japan2020

    • Author(s)
      Yamaguchi Teruhide、Uchida Eriko、Okada Takashi、Ozawa Keiya、Onodera Masafumi、Kume Akihiro、Shimada Takashi、Takahashi Satoru、Tani Kenzaburo、Nasu Yasutomo、Mashimo Tomoji、Mizuguchi Hiroyuki、Mitani Kohnosuke、Maki Kazushige
    • Journal Title

      Hum Gene Ther

      Volume: 31 Pages: 1043-1053

    • DOI

      10.1089/hum.2020.156

    • NAID

      120007147867

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  • [Journal Article] Pathophysiological significance of Stim1 mutation in sympathetic response to stress and cardiovascular phenotypes in SHRSP/Izm: In vivo evaluation by creation of a novel gene knock-in rat using CRISPR/Cas92020

    • Author(s)
      Odongoo Batbayar、Ohara Hiroki、Ngarashi Davis、Kaneko Takehito、Kunihiro Yayoi、Mashimo Tomoji、Nabika Toru
    • Journal Title

      Clinical and Experimental Hypertension

      Volume: 43 Pages: 34-41

    • DOI

      10.1080/10641963.2020.1797085

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  • [Journal Article] Combi-CRISPR : combination of NHEJ and HDR provides efficient and precise plasmid-based knock-ins in mice and rats2020

    • Author(s)
      Yoshimi K, Oka Y, Miyasaka Y, Kotani Y, Yasumura M, Uno Y, Hattori K, Tanigawa A, Sato M, Oya M, Nakamura K, Matsushita N, Kobayashi K, Mashimo T
    • Journal Title

      Human Genetics

      Volume: 140 Issue: 2 Pages: 277-287

    • DOI

      10.1007/s00439-020-02198-4

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  • [Journal Article] Generation of knockout rabbits with X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) using CRISPR/Cas92020

    • Author(s)
      Hashikawa Yoshiko、Hayashi Ryuhei、Tajima Masaru、Okubo Toru、Azuma Shohei、Kuwamura Mitsuru、Takai Naofumi、Osada Yasuyuki、Kunihiro Yayoi、Mashimo Tomoji、Nishida Kohji
    • Journal Title

      Sci Rep.

      Volume: 10 Pages: 9957-9957

    • DOI

      10.1038/s41598-020-66780-6

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      2020 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Assembly and Function of a Bioengineered Human Liver for Transplantation Generated Solely from Induced Pluripotent Stem Cells2020

    • Author(s)
      Takeishi Kazuki、Collin de l’Hortet Alexandra、Wang Yang、Handa Kan、Mashimo Tomoji、Fox Ira J.、Soto-Gutierrez Alejandro
    • Journal Title

      Cell Reports

      Volume: 31 Pages: 107711-107711

    • DOI

      10.1016/j.celrep.2020.107711

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      2020 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] LOX-1 (Lectin-Like Oxidized Low-Density Lipoprotein Receptor-1) Deletion Has Protective Effects on Stroke in the Genetic Background of Stroke-Prone Spontaneously Hypertensive Rat2020

    • Author(s)
      Liang Yi-Qiang、Kakino Akemi、Matsuzaka Yasunari、Mashimo Tomoji、Isono Masato、Akamatsu Tomohisa、Shimizu Hana、Tajima Michiko、Kaneko Takehito、Li Lei、Takeuchi Fumihiko、Sawamura Tatsuya、Kato Norihiro
    • Journal Title

      Stroke

      Volume: 51 Pages: 1835-1843

    • DOI

      10.1161/strokeaha.120.029421

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    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] ゲノム編集医療-技術開発・治療応用戦略を中心に、特集コーディネーター2020

    • Author(s)
      真下 知士、吉見 一人
    • Journal Title

      遺伝子医学

      Volume: 第10巻第4号(通巻34号) Pages: 1-176

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  • [Journal Article] 新規ゲノム編集ツールCRISPR-Cas32020

    • Author(s)
      真下 知士、吉見 一人
    • Journal Title

      Precision Medicine

      Volume: 3(6) Pages: 512-515

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  • [Journal Article] 効率的なゲノム編集ラットの作製方法2020

    • Author(s)
      服部晃佑、吉見一人、松下夏樹、小林和人、真下知士
    • Journal Title

      マウス・ラットモデル作製・解析プロフェッショナル. あなたの研究をステップアップさせる最新・最適手技. 先端モデル動物支援プラットフォーム(AdAMS)

      Volume: - Pages: 54-63

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  • [Journal Article] ゲノム編集技術CRISPR-Cas3とその遺伝子治療および診断への応用2020

    • Author(s)
      藤井智明、吉見一人、真下知士
    • Journal Title

      実験医学(増刊)新規の創薬モダリティ 細胞医療

      Volume: Vol.38, No.17 Pages: 49-54

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    • Author(s)
      山内祐子、真下知士
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      日本臨牀増刊号「高血圧学(上)」

      Volume: 78巻 Pages: 379-384

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    • Author(s)
      吉見一人、真下知士
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      Volume: Vol.273(9) Pages: 751-755

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      医学のあゆみ「ゲノム編集の未来」

      Volume: Vol.273(9) Pages: 785-794

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    • Author(s)
      Nakazawa Y, Hara Y, Oka Y, Komine O, van den Heuvel D, Guo C, Daigaku Y, Isono M, He Y, Shimada M, Kato K, Jia N, Hashimoto S, Kotani Y, Miyoshi Y, Tanaka M, Sobue A, Mitsutake N, Suganami T, Masuda A, Ohno K, Nakada S, Mashimo T, Yamanaka K, Luijsterburg MS, Ogi T
    • Journal Title

      Cell

      Volume: 19 Pages: 1228-1244

    • DOI

      10.1016/j.cell.2020.02.010

    • NAID

      120006871293

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  • [Journal Article] Pathological characteristics of <i>Ccdc85c</i> knockout rats: a rat model of genetic hydrocephalus2020

    • Author(s)
      Konishi S, Tanaka N, Mashimo T, Yamamoto T, Sakuma T, Kaneko T, Tanaka M, Izawa T, Yamate J, Kuwamura M
    • Journal Title

      Exp. Anim.

      Volume: 69 Issue: 1 Pages: 26-33

    • DOI

      10.1538/expanim.19-0005

    • NAID

      130007791587

    • ISSN
      0007-5124, 1341-1357, 1881-7122
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  • [Journal Article] Endothelial Cell-Selective Adhesion Molecule Contributes to the Development of Definitive Hematopoiesis in the Fetal Liver2019

    • Author(s)
      Ueda Tomoaki、Yokota Takafumi、Okuzaki Daisuke、Uno Yoshihiro、Mashimo Tomoji、Kubota Yoshiaki、Sudo Takao、Ishibashi Tomohiko、Shingai Yasuhiro、Doi Yukiko、Ozawa Takayuki、Nakai Ritsuko、Tanimura Akira、Ichii Michiko、Ezoe Sachiko、Shibayama Hirohiko、Oritani Kenji、Kanakura Yuzuru
    • Journal Title

      Stem Cell Reports

      Volume: 13 Pages: 992-1005

    • DOI

      10.1016/j.stemcr.2019.11.002

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    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] CRISPR-Cas3 induces broad and unidirectional genome editing in human cells2019

    • Author(s)
      Morisaka Hiroyuki、Yoshimi Kazuto、Okuzaki Yuya、Gee Peter、Kunihiro Yayoi、Sonpho Ekasit、Xu Huaigeng、Sasakawa Noriko、Naito Yuki、Nakada Shinichiro、Yamamoto Takashi、Sano Shigetoshi、Hotta Akitsu、Takeda Junji、Mashimo Tomoji
    • Journal Title

      Nature communications

      Volume: 10 Pages: 5302-5302

    • DOI

      10.1038/s41467-019-13226-x

    • NAID

      120006848247

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  • [Journal Article] Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation2019

    • Author(s)
      Gurumurthy Channabasavaiah B.、O’Brien Aidan R.、Quadros Rolen M.、Adams John、Alcaide Pilar、Ayabe Shinya、Ballard Johnathan、Batra Surinder K.、Beauchamp Marie-Claude、Becker Kathleen A.、Bernas Guillaume、Ohtsuka Masato他
    • Journal Title

      Genome Biology

      Volume: 20 Pages: 171-171

    • DOI

      10.1186/s13059-019-1776-2

    • NAID

      120007127906

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  • [Journal Article] Null mutation of the endothelin receptor type B gene causes embryonic death in the GK rat2019

    • Author(s)
      Wang Jinxi、Dang Ruihua、Miyasaka Yoshiki、Hattori Kousuke、Torigoe Daisuke、Okamura Tadashi、Tag-EI-Din-Hassan Hassan T.、Morimatsu Masami、Mashimo Tomoji、Agui Takashi
    • Journal Title

      PLOS ONE

      Volume: 14

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0217132

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  • [Journal Article] 疾患モデルラットの国内外トレンド2019

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      真下知士
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      実験動物技術

      Volume: 54 Pages: 91-95

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      吉見一人、真下知士
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      実験医学別冊 ゲノム編集実験スタンダード

      Volume: X

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      山内祐子、吉見一人、真下知士
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      LABIO21実験動物としてのラットの有用性

      Volume: 78 Pages: 16-19

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    • Author(s)
      真下 知士
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      メディカル・サイエンス・ダイジェスト

      Volume: 45 Pages: 17-20

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    • Author(s)
      Masato Kinboshi , Saki Shimizu, Tomoji Mashimo, Tadao Serikawa, Hidefumi Ito, Akio Ikeda, Ryosuke Takahashi, Yukihiro Ohno
    • Journal Title

      Int. J. Mol. Sci.

      Volume: 20 Pages: 001-015

    • DOI

      10.3390/ijms20051013

    • NAID

      120007006242

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    • Author(s)
      Kazuki Yasuhiro、Kobayashi Kaoru、他23名
    • Journal Title

      Proceedings of the National Academy of Sciences

      Volume: 116 Pages: 3072-3081

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      10.1073/pnas.1808255116

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    • Author(s)
      Mahal Zinat、Fujikawa Koichi、Matsuo Hiroyuki、Zahid Hasan M.、Koike Masamichi、Misumi Masaki、Kaneko Takehito、Mashimo Tomoji、Ohara Hiroki、Nabika Toru
    • Journal Title

      Hypertension Research

      Volume: 42 Pages: 610-617

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      American Journal of Physiology-Renal Physiology

      Volume: 315

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      10.1152/ajprenal.00370.2018

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    • Journal Title

      BMC Genomics

      Volume: 19 Pages: 000-000

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      10.1186/s12864-018-4713-y

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Published: 2018-04-23   Modified: 2021-12-27  

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