Molecular understanding of osmotic stress sensing and response

• Project/Area Number: 18H03995
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Review Section: Medium-sized Section 44:Biology at cellular to organismal levels, and related fields
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 一條 秀憲 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 教授 (00242206)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥44,460,000 (Direct Cost: ¥34,200,000、Indirect Cost: ¥10,260,000); Fiscal Year 2020: ¥13,650,000 (Direct Cost: ¥10,500,000、Indirect Cost: ¥3,150,000); Fiscal Year 2019: ¥13,780,000 (Direct Cost: ¥10,600,000、Indirect Cost: ¥3,180,000); Fiscal Year 2018: ¥17,030,000 (Direct Cost: ¥13,100,000、Indirect Cost: ¥3,930,000)
• Keywords: ASK3 / 浸透圧受容 / 浸透圧応答 / 細胞体積 / 浸透圧ストレス受容 / 細胞体積制御 / 浸透圧ストレス応答 / VRAC/LRRC8 / アポトーシス

Outline of Annual Research Achievements

細胞の浸透圧ストレス応答機構は古い研究分野にも関わらず，浸透圧が定量的に扱い難く，その受容・応答の分子機構は特に哺乳類細胞において十分に解明されていない．研究代表者はセリン・スレオニンキナーゼであるASKファミリーの研究を通して，ASK3が低・高浸透圧ストレスに対して両方向に活性を変化させ，細胞体積の回復を調節する重要な鍵分子であることを明らかにしてきた．そこで本研究では，ASK3を解析の中心に据えて①浸透圧ストレスの受容と②応答機構，③他の細胞機能への関連性を解析することで，哺乳類細胞における浸透圧ストレスの受容から応答に至る分子機構を解明し，さらには細胞体積制御の観点から様々な疾患の新規治療法や創薬基盤の開発に資することを目的としている．
本年度は当初の計画通り，ASK3を解析の中心据えて①浸透圧ストレスの受容と②応答機構，③他の細胞機能への関連性の大きく３つのパートに分けて進めた．その結果【現在までの進捗状況】に示す通り，各パートにおいて想定を上回るほど着実に結果を蓄積することができ，本研究目的の達成に向けて大幅に進展した．特に③は挑戦的なパートであったが，ASK3が浸透圧ストレス応答と同様に細胞体積制御を介してアポトーシスを誘導することを示唆する結果を得た．元々ASKファミリーはアポトーシス制御分子として研究されてきた経緯もあり，進化の選択圧を踏まえると，なぜ細胞はアポトーシス誘導能を有するASK3を浸透圧ストレスにおける恒常性維持機構でも利用するのか疑問であった．しかし本成果によって，浸透圧ストレス応答とアポトーシス誘導時の共通の現象である細胞収縮において細胞はASK3を介した共通機構を利用している可能性が示唆され，本研究が細胞の合理的な基本原理の一端に迫っている可能性を意味する．
従って，来年度も引き続き解析を進めることで本研究目的を十分達成できると期待される．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

以下に示す計画ごとに概ね順調な進捗が得られた。
① 浸透圧ストレス受容機構：これまでに研究代表者は浸透圧をASK3活性に変換して定量するという独創的な発想の下，両浸透圧ストレスにおけるゲノムワイドsiRNAスクリーニングを行い，浸透圧受容を担う分子候補を網羅的に得ていた．そこで本年度はスクリーニングで得た候補分子の機能解析を進めた結果，実際に新規ASK3活性制御分子の同定に成功した．
② 浸透圧ストレス応答機構：低浸透圧ストレス時の体積回復を担う分子としてイオンチャネルVRACが提唱されていたが，その分子実体は最近になって漸くLRRC8sだと同定された．その報告後，研究代表者はASK3がVRAC活性に必要であることを見出していた．そこで本年度は分子レベルでの制御機構解明が待望されているLRRC8sに対してASK3の関与を検証した．その結果，VRAC必須構成分子LRRC8AがASK3によってリン酸化されることを明らかにし，そのリン酸化部位の候補を得た．
③ 他の細胞機能との関連性：アポトーシスの形態的特徴として細胞収縮が知られるが，細胞はVRACを利用して縮むことが示唆されている．これまでに研究代表者はASKファミリーのアポトーシスにおける重要性を明らかにしてきたが，ASK3がVRAC活性や細胞体積を制御できることを踏まえると，ASK3が細胞体積調節を介してもアポトーシス誘導に寄与する仮説が想定できた．そこで本年度は浸透圧ストレス応答に限らず，アポトーシスにおいてもASK3-VRACが細胞体積収縮に関与する仮説を検証した．その結果，ASK3-VRACが酸化ストレスにおける細胞収縮とアポトーシス誘導に必要なことを明らかにした．

Strategy for Future Research Activity

来年度も引き続き解析を進めることで本研究目的を十分達成できると期待されるため，今年度同様，３つのパートを並行して進める．
①浸透圧ストレス受容機構：本年度までに蓄積してきた結果を基に，ASK3活性制御分子間の関係を検証するなど，より大局的な視点からの検証を進め，体系的な理解へとつなげることを目指す．また，これまでに研究代表者は高浸透圧ストレス時にASK3の細胞内局在がダイナミックに変化する現象を見出していたが，その意義については長らく不明であった．しかしASK3活性の制御分子を同定したことで，高浸透圧ストレスによるASK3の細胞内局在変化がliquid-liquid phase separation（液－液相分離）によって引き起こされ，ASK3の不活性化に必要であるという発想に至った．この仮説は浸透圧ストレス受容の根源に迫るものであり，最優先で検証を進める．
②浸透圧ストレス応答機構：本年度に得たASK3依存的なLRRC8Aのリン酸化候補部位について， 変異体を作製してVRAC活性に影響するか，抗リン酸化抗体を作製して低浸透圧ストレス依存的に変化するかなどを検証することで，低浸透圧ストレスにおけるASK3のVRAC制御機構の解明を目指す．
③他の細胞機能との関連性：本年度にASK3が浸透圧ストレス応答と同様に細胞体積制御を介してアポトーシスを誘導することを示唆する結果を得たが，相関データに基づいているため未だ仮説の域を出ない．そこで②のパートと同様に，酸化ストレスにおけるASK3のVRAC制御機構を検証することで，仮説の実証を目指す．

Research Products

• [Journal Article] β-TrCP-dependent degradation of ASK1 suppresses the induction of the apoptotic response by oxidative stress (2018)
  • Author(s): Cheng Ran、Takeda Kohsuke、Naguro Isao、Hatta Tomohisa、Iemura Shun-ichiro、Natsume Tohru、Ichijo Hidenori、Hattori Kazuki
  • Journal Title: Biochim. Biophys. Acta, Volume: 1862 Pages: 2271-2280
  • DOI: 10.1016/j.bbagen.2018.07.015
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A small-molecule inhibitor of SOD1-Derlin-1 interaction ameliorates pathology in an ALS mouse model (2018)
  • Author(s): Tsuburaya, N., Homma, K., Higuchi, T., Balia, A., Yamakoshi, H., Shibata, N., Nakamura, S., Nakagawa, H., Ikeda, S., Umezawa, N., Kato, N., Yokoshima, S., Shibuya, M., Shimonishi, M., Kojima, H., Okabe, T., Nagano, T., Naguro, I., Imamura, K., Inoue, H., Fujisawa, T., and Ichijo, H.
  • Journal Title: Nat Commun Volume: 9 Pages: 1-12
  • DOI: 10.1038/s41467-018-05127-2
  • NAID: 120006546002
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Cryo-EM structure of the volume-regulated anion channel LRRC8 (2018)
  • Author(s): Kasuya Go、Nakane Takanori、Yokoyama Takeshi、Jia Yanyan、Inoue Masato、Watanabe Kengo、Nakamura Ryoki、Nishizawa Tomohiro、Kusakizako Tsukasa、Tsutsumi Akihisa、Yanagisawa Haruaki、Dohmae Naoshi、Hattori Motoyuki、Ichijo Hidenori、Yan Zhiqiang、Kikkawa Masahide、Shirouzu Mikako、Ishitani Ryuichiro、Nureki Osamu
  • Journal Title: Nat. Struct. Mol. Biol. Volume: 25 Pages: 797-804
  • DOI: 10.1101/331207
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] ASK family kinases mediate cellular stress and redox signaling to circadian clock (2018)
  • Author(s): Imamura Kiyomichi、Yoshitane Hikari、Hattori Kazuki、Yamaguchi Mitsuo、Yoshida Kento、Okubo Takenori、Naguro Isao、Ichijo Hidenori、Fukada Yoshitaka
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Volume: 115 Pages: 3646-3651
  • DOI: 10.1073/pnas.1719298115
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A PP6-ASK3 module coordinates the bidirectional cell volume regulation under osmotic stress (2018)
  • Author(s): Watanabe Kengo、Umeda Tsuyoshi、Niwa Kuniyoshi、Naguro Isao、Ichijo Hidenori
  • Journal Title: Cell Rep. Volume: 22 Pages: 2809-2817
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2018.02.045
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018 (2018)
  • Author(s): Galluzzi, L. et al.
  • Journal Title: Cell Death & Differentiation Volume: 25 Pages: 486-541
  • DOI: 10.1038/s41418-017-0012-4
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Role of ASK1/p38 Cascade in a Mouse Model of Alzheimer’s Disease and Brain Aging (2018)
  • Author(s): Hasegawa Yu、Toyama Kensuke、Uekawa Ken、Ichijo Hidenori、Kim-Mitsuyama Shokei
  • Journal Title: Journal of Alzheimer's Disease Volume: 61 Pages: 259-263
  • DOI: 10.3233/jad-170645
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] mASKing cancer cells in a tumor microenvironment (2018)
  • Author(s): Kamiyama Miki、Naguro, Isao、Ichijo Hidenori
  • Journal Title: Cell Cycle Volume: 17 Pages: 139-140
  • DOI: 10.1080/15384101.2017.1407402
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Apoptosis Signal-regulating Kinase 1 in Regulated Necrosis. (2018)
  • Author(s): Hattori Kazuki、Ichijo Hidenori
  • Journal Title: Cell Cycle. Volume: 17 Pages: 1-2
  • DOI: 10.1080/15384101.2017.1397330
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] ASK3 modulates cell volume under osmotic stress and beyond. (2018)
  • Author(s): 渡邊謙吾、一條秀憲
  • Organizer: 第10回シグナルネットワーク研究会
• [Presentation] ストレスシグナルによる神経変性制御 (2018)
  • Author(s): 一條秀憲
  • Organizer: 第41回日本神経科学大会
  • Invited
• [Presentation] ASK3による体積調節を介した細胞死制御 (2018)
  • Author(s): 井上雅斗、渡邊謙吾、一條秀憲
  • Organizer: 第91回日本生化学会大会
• [Presentation] ASK1はNOD-RIPK2経路を制御する (2018)
  • Author(s): 高柳早希、渡邊謙吾、一條秀憲
  • Organizer: 第91回日本生化学会大会
• [Presentation] プロテアソーム依存的なASK3の不活性化による高浸透圧ストレス応答の制御 (2018)
  • Author(s): 周翔宇、渡邊謙吾、森下和浩、名黒功、一條秀憲
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会
• [Presentation] ASK3による体積調節を介した細胞死制御 (2018)
  • Author(s): 井上雅斗、渡邊謙吾、一條秀憲
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会
• [Presentation] ASK3不活性化における高浸透圧ストレスセンサー候補分子TRPML1の機能解析 (2018)
  • Author(s): 森下和浩、渡邊謙吾、一條秀憲
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会