| Project/Area Number |
18H05270
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Broad Section G
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
上田 泰己 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 教授 (20373277)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
洲崎 悦生 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 准教授 (10444803)
大出 晃士 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 講師 (40612122)
清成 寛 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (40721048)
史 蕭逸 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 助教 (40803656)
山田 陸裕 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 上級研究員 (90469924)
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| Project Period (FY) |
2018-06-11 – 2023-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2020)
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| Budget Amount *help |
¥200,330,000 (Direct Cost: ¥154,100,000、Indirect Cost: ¥46,230,000)
Fiscal Year 2021: ¥19,370,000 (Direct Cost: ¥14,900,000、Indirect Cost: ¥4,470,000)
Fiscal Year 2020: ¥19,890,000 (Direct Cost: ¥15,300,000、Indirect Cost: ¥4,590,000)
Fiscal Year 2019: ¥19,890,000 (Direct Cost: ¥15,300,000、Indirect Cost: ¥4,590,000)
Fiscal Year 2018: ¥122,590,000 (Direct Cost: ¥94,300,000、Indirect Cost: ¥28,290,000)
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| Keywords | 可逆的リン酸化 / 振動子 / 概日時計 / CKI / 変異マウス作製 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、CKIδ/εを中心として、概日時計タンパク質が有する可逆的リン酸化制御機構の詳細な解析とマウス個体での表現型解析を用いてCKIファミリーを用いて可逆的リン酸化振動体を設計し、さらに生体リズム振動体一般の理解を目指すことを目指す。2年目である平成31/令和元年度は、CKIδ/εの脱リン酸化活性を制御するリン酸化ペプチドの探索を行った。さらに、脱リン酸化活性を制御する基質リン酸化サイトの個体行動制御における意義を検証するための新しい技術開発に着手した。
【1. CKIδ/ε脱リン酸化活性制御機構の解明】 CKIδ/εの基質となるタンパク質領域に着目し、一連のペプチド基質、リン酸化ペプチド基質を合成した。合成したリン酸化ペプチドの存在下でCKIδ/εの脱リン酸化活性を測定したところ、いくつかのリン酸ペプチドはCKIδ/εの脱リン酸化活性を変化させることが明らかとなった。
【2. CKIδ/ε脱リン酸化活性の個体レベルにおける意義の検証】この現象の個体レベルでの意義を解析するために、これまでに開発してきた遺伝子ノックインマウス、ノックインマウスの作出技術をさらに発展させた。特に、ノックアウトESマウスに対して変異遺伝子を導入し、行動リズムのノックアウト表現型を相補する実験系の改良に成功し、複数の変異遺伝子による行動リズム相補活性の変化を効率よく調べることが可能になりつつある。
【3. CKIファミリーを用いた可逆的リン酸化振動体の設計】 数理モデル解析から、リン酸化酵素が脱リン酸化反応も触媒し、その活性が基質のリン酸化状態によって制御されるならば、自律的な可逆的リン酸化振動が惹起されうること、そのために重要であるいくつかの特徴的な制御パターンがあることを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は当初の計画通りCKIδ/εの脱リン酸化活性を実際に制御する複数のリン酸化基質の同定に至った。これは、提案時の仮説（単にリン酸化活性と脱リン酸化活性が拮抗するだけでは振動子としての性質に至らないため、基質のリン酸化状態に応じた脱リン酸化活性調節があるはずである）にまさに対応したものである。
この特徴的な活性をもつ基質リン酸化状態の個体レベルにおける意義を検証するため、内在性遺伝子にタグ配列を導入するための実験系を整備したほか、ノックアウトESマウスに対して変異遺伝子を導入し、行動リズムのノックアウト表現型を相補する実験系の改良に成功した。この結果、生化学アッセイから見出された複数のCKIδ/ε脱リン酸化活性制御性リン酸化基質の個体行動制御における意義を検証する準備が整いつつあり、生化学実験の結果をうけて個体レベルでの解析を本格化する研究後半の展開にむけて予定通りの進展である。
また、数理モデルを用いた解析は昨年度より引き続き、生化学実験の結果を随時取り込みつつ先行して行っており、自律発振を惹起するためには、特定のリン酸化パターンの基質が（脱）リン酸化活性を制御することが必要であることを裏付けることに成功した。 また可逆的リン酸化による振動子の存在可能性について、包括的な議論を総説や国内外の学会で発表している。
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| Strategy for Future Research Activity |
特定のリン酸化基質の存在に依存した、CKIδ/εの脱リン酸化活性の制御機構の生化学的な詳細を調べる。具体的には、リン酸化基質とCKIδ/εの直接的な相互作用様式や、どういった特徴をもつリン酸化基質がCKIδ/εの脱リン酸化活性の制御を行うのかを、変異体解析等を通して明らかにする。
この新規CKIδ/ε脱リン酸化活性制御機構に寄与するタンパク質領域やアミノ酸残基が明らかになったならば、それらの領域やアミノ酸残基に変異を導入した変異タンパク質を発現するマウス個体を作出し、行動リズムに与える影響を調べる。これにより、CKIδ/ε脱リン酸化活性制御の個体レベルでの意義を評価する。
また、これらの解析によって重要であることが確認された脱リン酸化活性制御能をもつ基質とCKIδ/εを試験管内で反応させることで、振動体としての振る舞いやその一部を可逆的リン酸化を用いて再構成する。CKIδ/εのリン酸化/脱リン酸化活性スイッチがCKIδ/ε自身によって惹起されうるかを検証するために、まずは、見出された脱リン酸化活性活性化ペプチドが、CKIδ/εによってリン酸化されるかを検証する。CKIδ/εによるリン酸化を受けるように、ペプチド周辺配列の工夫を行うとともに、適宜より長いペプチド（および全長基質タンパク質）の使用を適宜検討する。
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