| Project/Area Number |
18H05270
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Broad Section G
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
上田 泰己 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 教授 (20373277)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大出 晃士 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 講師 (40612122)
清成 寛 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (40721048)
史 蕭逸 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 助教 (40803656)
山田 陸裕 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 上級研究員 (90469924)
洲崎 悦生 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 准教授 (10444803)
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| Project Period (FY) |
2018-06-11 – 2023-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2021)
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| Budget Amount *help |
¥200,330,000 (Direct Cost: ¥154,100,000、Indirect Cost: ¥46,230,000)
Fiscal Year 2022: ¥18,590,000 (Direct Cost: ¥14,300,000、Indirect Cost: ¥4,290,000)
Fiscal Year 2021: ¥19,370,000 (Direct Cost: ¥14,900,000、Indirect Cost: ¥4,470,000)
Fiscal Year 2020: ¥19,890,000 (Direct Cost: ¥15,300,000、Indirect Cost: ¥4,590,000)
Fiscal Year 2019: ¥19,890,000 (Direct Cost: ¥15,300,000、Indirect Cost: ¥4,590,000)
Fiscal Year 2018: ¥122,590,000 (Direct Cost: ¥94,300,000、Indirect Cost: ¥28,290,000)
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| Keywords | 可逆的リン酸化 / 振動子 / 概日時計 / CKI / 変異マウス作製 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、CKIδ/εを中心として、概日時計タンパク質が有する可逆的リン酸化制御機構の詳細な解析とマウス個体での表現型解析を用いてCKIファミリーを用いて可逆的リン酸化振動体を設計し、さらに生体リズム振動体一般の理解を目指すことを目指す。3年目は、CKIδ/εの脱リン酸化活性を制御するリン酸化ペプチドの同定を経て、その性状解析を行った。また、脱リン酸化活性やその制御の個体行動制御における意義を検証するための新しい技術開発を継続して行い、一定の成果を得た。
【1. CKIδ/ε脱リン酸化活性制御機構の解明】PER2やCRY1に由来するリン酸化ペプチドによるCKIδ/ε脱リン酸化活性の包括的な測定を行い、脱リン酸化活性を制御するペプチドと制御しないペプチドは、それらが由来するタンパク質上にランダムに存在するのではなく、ある程度集積して存在することが示唆された。すなわち、PER2やCRY1には、CKIδ/ε脱リン酸化活性の制御ドメインがあることが示唆された。
【2. CKIδ/ε脱リン酸化活性の個体レベルにおける意義の検証】個体レベルでの概日行動リズムが消失するPERやCRYのノックアウトマウスに対して、後天的にPERやCRYを発現誘導することで概日行動リズムを惹起する系の条件検討をさらに進めた。また、CKIについても、後天的にマウス個体に対して発現誘導した際に、個体レベルでの行動リズムにどのような影響が生じるのかを調べる実験系の構築に着手した。
【3. CKIファミリーを用いた可逆的リン酸化振動体の設計】上記、1.のペプチド基質を用いた脱リン酸化活性の制御探索と相補的に、全長PER2やCRY1によるCKIδ/εの制御機構を探索するため、全長PER2やCRY1の発現・精製系をセットアップした。また、昨年度までに一定の結論を得ていた、可逆的リン酸化による振動体の数理モデルに関連して、発展的にこのモデルがカオス的振る舞いを示す際の数理条件を探求した成果を論文発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、昨年度までの研究成果を発展させ、CKIδ/εの基質タンパク質に脱リン酸化活性の制御ドメインがあることを示唆する結果を得た。これは、これまで探求していたペプチド基質に基づく脱リン酸化活性制御が、実際の概日時計タンパク質に備わる特性であることを示唆しており、重要なステップである。また、これをうけて、全長PER2やCRY1の発現精製系の構築に着手し、概ね順調に立ち上がった。また、当初計画から進めていた可逆的リン酸化モデルの数理解析から発展的に生じた成果として、カオス的振る舞いが生じる際の条件について論文発表した。
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| Strategy for Future Research Activity |
【1. CKIδ/ε脱リン酸化活性制御機構の解明】
これまでの研究で、CKIδ/εの脱リン酸化活性を制御するリン酸化ペプチドを複数得ることができ、脱リン酸化制御をアッセイするためのTypicalな条件が整った。これによって、これらの複数の脱リン酸化制御ペプチドに、明確な配列保存性は見られないことが確からしくなった、脱リン酸化制御にあたって、リン酸化ペプチドのどういった特性が必要なのかを、人工的な疑似リン酸化修飾などを用いて調べる。また、CKIδ/εの脱リン酸化活性制御が自律的に生じるための条件を引き続き探索する。
【2. CKIδ/ε脱リン酸化活性の個体レベルにおける意義の検証】
ウイルスベクターを用いたマウス個体の概日リズムに摂動を与える系を、個体の活動リズムの有無によって明確な摂動効率の判定が可能な、PerやCryを用いてきたが、さらにCKIによる個体レベルの表現型への影響をより直接的に検証するために、CKIを用いた摂動系を構築する。これにより、脱リン酸化制御効率に異常がある変異CKIが、マウス個体にどのような影響を及ぼすのかを調べる。
【3. CKIファミリーを用いた可逆的リン酸化振動体の設計】
可逆的リン酸化振動体の数理モデルについては、当初予定されていたモデリングの主要な部分を達成しているため、さらに発展的な内容として、CaMKII等の脱リン酸化活性の存在が報告されてはいるが、その意義が明らかでない酵素を対象として、その活性制御機構を生化学的に検討するためのアッセイ系を構築する。
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| Assessment Rating |
Interim Assessment Comments (Rating)
A: In light of the aim of introducing the research area into the research categories, the expected progress has been made in research.
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