| Project/Area Number |
18H05283
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Broad Section I
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
小守 壽文 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (00252677)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
姜 晴 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (00790007)
宮崎 敏博 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (10174161)
森石 武史 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (20380983)
川根 徹也 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 客員研究員 (00265208)
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| Project Period (FY) |
2018-06-11 – 2023-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2020)
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| Budget Amount *help |
¥193,440,000 (Direct Cost: ¥148,800,000、Indirect Cost: ¥44,640,000)
Fiscal Year 2021: ¥38,350,000 (Direct Cost: ¥29,500,000、Indirect Cost: ¥8,850,000)
Fiscal Year 2020: ¥39,260,000 (Direct Cost: ¥30,200,000、Indirect Cost: ¥9,060,000)
Fiscal Year 2019: ¥40,820,000 (Direct Cost: ¥31,400,000、Indirect Cost: ¥9,420,000)
Fiscal Year 2018: ¥42,250,000 (Direct Cost: ¥32,500,000、Indirect Cost: ¥9,750,000)
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| Keywords | 発現制御 / 細胞・組織 / 発生・分化 / 歯学 / Runx2 / FGF / Wnt / ヘッジホッグ / オステオカルシン / Antxr1 / Hck |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）骨芽細胞を供給するために骨芽細胞前駆細胞の増殖が必須であるが、そのメカニズムは明らかになっていなかった。Runx2は、骨芽細胞分化だけでなく、骨芽細胞前駆細胞の増殖に必須であり、Fgfr2, Fgfr3を直接発現制御することにより、骨芽細胞前駆細胞の増殖を誘導することを明らかにした。
２）Runx2は、ヘッジホッグ、FGF、Wnt、Pthlhシグナル経路遺伝子の発現を誘導、頭蓋縫合の間葉系細胞の増殖および骨芽細胞系列への分化を誘導し、頭蓋骨形成へと導くことを明らかにした。さらに、Runx2によるこれらの遺伝子発現誘導は、Runx2が半量では十分に起こらず、頭蓋の低形成が起こることを明らかにした。
３）非コラーゲン性骨基質タンパク質で最も豊富なオステオカルシンは、骨芽細胞特異的に発現しており、その発現はRunx2によって制御される。オステオカルシンの機能は、骨のアパタイト結晶の成長方向の制御であり骨強度に重要な役割を果たすことを明らかにした。
４）Antxr1/Tem8はGAPO（growth retardation, alopecia, pseudo-anodontia, and optic atrophy）症候群の原因遺伝子であり、炭疽菌のレセプターでもある。Antxr1が軟骨で高発現しておりRunx2により発現制御されること、Antxr1は軟骨細胞の増殖を制御し、その異常により成長障害が起こることを明らかにした。Hckは、Srcファミリーの非レセプター型チロシンキナーゼである。Hckは軟骨細胞に高発現しており、Runx2によって発現制御されること、Hckはヘッジホッグ、Wntシグナルを活性化し、軟骨細胞の増殖を促進させることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Runx2とFgfシグナルとの相互制御による、骨芽細胞前駆細胞の増殖制御機構の解明、Runx2と各種シグナル(Fgf、ヘッジホッグ、Wnt、Pthlh）およびSp7との相互制御による骨芽細胞分化決定機構の解明は、エンハンサー活性化機構の解明に直接貢献する成果である。
Antxr1とHck の軟骨細胞での発現および機能は、これまで全く報告されていない。Antxr1とHckは軟骨細胞で高発現し、Runx2によって直接転写制御され、軟骨細胞の増殖を誘導する分子であることを明らかにしたことは、軟骨細胞におけるRunx2の機能を解明したものであり、本研究課題の軟骨細胞におけるRunx2の発現制御機構がどのような生理的役割を持つかを明らかにした成果である。
オステオカルシンは骨芽細胞特異的に発現しており、Runx2によって発現制御されることが最初に見つけられた遺伝子である。しかし、その機能は１グループによって様々に報告されてきた。Runx2の骨芽細胞特異的発現によって制御されるオステオカルシンの機能を明らかにしたことは、Runx2の骨芽細胞・軟骨細胞特異的発現の生理的役割を解明したものであり、本研究と密接に関連し、その意義を高めるものである。この成果は、長年謎であった石灰化の方向性を決めるメカニズムを明らかにしたものであり、それ自身大きな学術的意義がある。さらに、これまでNatureやCell等に多数報告され、その後の多くの研究に多大な影響を及ぼしたオステオカルシンに関する全ての報告が、全く再現性のない結果であったことを示すものであり、PLOS Geneticsで本成果をハイライトするPerspective articleとともに掲載される。掲載時にはPLOS Geneticsからプレスリリースされ、学術領域全般に影響を与える成果である。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）cDNAライブラリースクリーニングにより、軟骨細胞特異的エンハンサーを活性化する転写因子・共役因子を同定する。enChIP法により軟骨細胞特異的エンハンサー、骨芽細胞特異的エンハンサー結合タンパク質を同定する。capture Hi-Cにより、エンハンサー間及びプロモーターと相互作用する領域を決定する。
２）ルシフェラーゼベクターを安定発現するSW1535細胞株を用いた化合物スクリーニングで、軟骨細胞特異的エンハンサーの抑制化合物、活性化合物を選択する。さらに選択した化合物によるRunx2 mRNAの変化をreal time RT-PCRで調べる。Runx2 mRNAを増加あるいは減少させた化合物は、初期培養軟骨細胞のマイクロマス培養で、軟骨細胞分化に対する効果を調べる。化合物の標的タンパク質を検出するため、タンパク質ライブラリースクリーニング、相互作用マシンラーニング法Chemical Genomics-Based Virtual Screening (CGBVS)、マイクロアレイ解析、磁気ビーズ結合化合物およびprotoaffinityタグ結合化合物を用いた標的分子フィッシングを行う。
３）23エンハンサー候補のそれぞれの欠失マウスとRunx2ヘテロ変異マウスを交配し、一方の染色体上でRunx2を欠損させたマウスを作製する。Runx2ゲノム領域を含むTAD (topology associated domain)1700 kbの８箇所にloxPを挿入し、CAG-Creマウスと交配することにより、それぞれの領域を欠失させたマウスを作製し、生理的に必要なエンハンサー群を含む領域を特定する。
４）不活化したCas9 (dCas9)に転写抑制因子KRABを融合させたdCas9-KRABと、複数のエンハンサー領域を認識するguide RNAを受精卵に注入し、マウスにおいて複数のエンハンサー候補を同時に抑制する。
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