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Elucidation of the mechanism in the regulation of chondrocyte-specific Runx2 enhancer and development of the drug for osteoarthritis

Research Project

Project/Area Number 18H05283
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (S)

Allocation TypeSingle-year Grants
Review Section Broad Section I
Research InstitutionNagasaki University

Principal Investigator

小守 壽文  長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (00252677)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 姜 晴  長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (00790007)
宮崎 敏博  長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (10174161)
森石 武史  長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (20380983)
川根 徹也  長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 客員研究員 (00265208)
Project Period (FY) 2018-06-11 – 2023-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help
¥193,440,000 (Direct Cost: ¥148,800,000、Indirect Cost: ¥44,640,000)
Fiscal Year 2022: ¥32,760,000 (Direct Cost: ¥25,200,000、Indirect Cost: ¥7,560,000)
Fiscal Year 2021: ¥38,350,000 (Direct Cost: ¥29,500,000、Indirect Cost: ¥8,850,000)
Fiscal Year 2020: ¥39,260,000 (Direct Cost: ¥30,200,000、Indirect Cost: ¥9,060,000)
Fiscal Year 2019: ¥40,820,000 (Direct Cost: ¥31,400,000、Indirect Cost: ¥9,420,000)
Fiscal Year 2018: ¥42,250,000 (Direct Cost: ¥32,500,000、Indirect Cost: ¥9,750,000)
KeywordsRunx2 / 軟骨細胞 / エンハンサー / 発現制御 / 細胞・組織 / 発生・分化 / 歯学 / 分化転換 / 血管進入 / アポトーシス / 骨芽細胞 / FGF / Wnt / ヘッジホッグ / オステオカルシン / Antxr1 / Hck
Outline of Annual Research Achievements

骨芽細胞分化後のRunx2の機能を解析するために、骨芽細胞分化後に発現する2.3 kb Col1a1プロモーターCre(Col1a1 Cre)の同じ系統マウスを用いたコンディショナルノックアウトマウスが2グループから報告された。1グループは、完全にRunx2の機能を欠損させたが、表現型はなく、もう一方では、Runx2のDNA結合能を保持し、機能が低下したRunx2タンパク質が形成され、骨量が減少した。これは、この異常なRunx2タンパク質が他のRunx分子を抑制したためと考えられる。したがって、Runx2の骨芽細胞分化後の機能は、未解明であった。
我々は、独自にCol1a1 Creマウスを作製し、Runx2を骨芽細胞分化後に欠失させた。骨量は、海面骨、皮質骨ともに減少し、骨形成は低下した。主要骨基質タンパク質であるCol1a1, Col1a2, Spp1, Ibsp, Bgalap/Bglap2は減少し、Runx2がこれらの遺伝子発現に必要であることを明らかにした。すなわち、骨芽細胞の主要機能である骨基質タンパク質発現に、Runx2は主要な役割を果たしていた。
骨細胞ネットワークは、骨量維持に重要な役割を果たしている。今回、骨の圧迫側と伸展側で、コラーゲン・骨小腔の配向、骨細管数、骨細管幅に差があることを明らかにした。骨の圧迫側では伸展側に比較し、コラーゲン・骨小腔は骨の長軸方向により規則正しく配置し、骨細管は密で細かった。これらは、メカニカルストレスの影響によると考えられた。さらに、骨小腔・骨細管構造の異常を持つ骨芽細胞特異的Sp7トランスジェニックマウスを解析し、骨細管の連結した骨細胞ネットワークは、非荷重時の反応を起こすに十分であるが、正常な骨細胞ネットワークが、非荷重時の圧迫・伸展側での異なるSost発現誘導および非荷重時の骨形成抑制からの回復に必要なことを明らかにした。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Runx2は、間葉系幹細胞から骨芽細胞系列への分化を決定し、骨芽細胞前駆細胞の増殖を促進させる。そして、未熟骨芽細胞へと分化させることを明らかにしてきた。しかし、骨芽細胞分化後のRunx2の機能は、解明されていなかった。Col1a1 Creを用いたコンディショナルノックアウトマウスは発表されていたが、同じCreマウスを用いていながら、完全にRunx2機能を破壊したマウスの方が表現型を認めないという結果になった。これは、Creマウスの効率が悪いことに起因すると考えられた。そこでGFP-Cre融合タンパク質によりCreの発現パターンも確認できるCol1a1 GFP-Creマウスを独自に作製し、Runx2を骨芽細胞分化後に完全に機能消失させた。このCreマウスを用いることにより、Runx2が主要な骨基質タンパク質遺伝子発現に重要な役割を果たすことを明らかにした。よって、Runx2の機能解析は順調に進展している。
骨細胞は、その細胞突起によって周辺の骨細胞や骨芽細胞とギャップ結合により連結されるとともに骨細管によって連結されている。そして、細管内の突起がシェアストレスを感知し、力学的ストレスに応答すると考えられている。骨小腔、骨細管を詳細に観察することにより、皮質骨の圧縮側と伸展側で、その構造に違いがあることを明らかにした。これは、骨の形成過程において、力学的ストレスによって骨の微細構造が決定されることを明らかにしたものであり、学術的意義が非常に高い。さらに骨小腔・骨細管構造が異常なマウスを解析することにより、力学的ストレス応答における骨細胞ネットワーク構造の必要条件および正常の骨細胞ネットワークの新たな機能を明らかにした。よって、骨細胞と力学的ストレスに関する研究は順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

1)II型コラーゲンプロモーターを用いたCol2a1-GFPマウスよりGFP陽性細胞(静止軟骨細胞および増殖軟骨細胞)を分離する。X型コラーゲンプロモーターを用いたCo10a1-Creマウス、Rosa26-CAG-loxP-mTFPマウス、I型コラーゲンプロモーターを用いたCol1a1-tomatoマウスを交配し、Co10a1-Cre-Rosa-tomatoマウスを作製する。このマウスでは、肥大軟骨細胞でmTFP(青緑色)、軟骨細胞から分化転換した骨芽細胞ではmTFPとtomatoの両者(白色)、その他の骨芽細胞ではtomatoのみ(赤色)を発現する。これらをFACSで分離採取する。1細胞完全長トータルRNAシーケンスにより、単一細胞レベルで網羅的遺伝子発現およびエンハンサーRNA発現を定量し、骨芽細胞・軟骨細胞の各分化段階マーカー遺伝子(分化段階の特定)とエンハンサーRNA(活性化エンハンサーの特定)の発現定量を行い、各分化段階で活性化されるエンハンサーを同定する。
2)上記で特定した活性化エンハンサーは、GFPレポーターマウスを作製する。凍結切片を作成し、GFPの蛍光観察を行う。骨芽細胞、軟骨細胞あるいはその両者に特異的にGFP発現を確認できたエンハンサーを選択する。
3)選択したエンハンサー候補領域は、CRISPR/Cas3の系を用い、複数の候補を同時に欠失させたマウスを作製する。ホモ欠損マウスを作製後、軟骨細胞の成熟、軟骨内骨化、膜性骨化を野生型マウスと比較評価する。また、Runx2 mRNAを定量し野生型マウスと比較する。これらにより、生理的に重要なエンハンサー群を特定する。
4)天然化合物ライブラリースクリーニングで軟骨細胞特異的エンハンサーを抑制した化合物の軟骨細胞分化における作用、毒性、濃度依存性を調べる。

Assessment Rating
Interim Assessment Comments (Rating)

A: In light of the aim of introducing the research area into the research categories, the expected progress has been made in research.

Report

(8 results)
  • 2021 Annual Research Report
  • 2020 Abstract (Interim Assessment) ( PDF )   Annual Research Report   Interim Assessment (Comments) ( PDF )
  • 2019 Annual Research Report
  • 2018 Abstract ( PDF )   Comments on the Screening Results ( PDF )   Annual Research Report

Research Products

(43 results)

All 2022 2021 2020 2019 2018

All Journal Article (30 results) (of which Int'l Joint Research: 7 results,  Peer Reviewed: 29 results,  Open Access: 23 results) Presentation (13 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results,  Invited: 2 results)

  • [Journal Article] Osteocytes: Their Lacunocanalicular Structure and Mechanoresponses2022

    • Author(s)
      Moriishi Takeshi、Komori Toshihisa
    • Journal Title

      International Journal of Molecular Sciences

      Volume: 23 Pages: 4373-4373

    • DOI

      10.3390/ijms23084373

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  • [Journal Article] Sp7 Transgenic Mice with a Markedly Impaired Lacunocanalicular Network Induced Sost and Reduced Bone Mass by Unloading2022

    • Author(s)
      Moriishi Takeshi、Ito Takuro、Fukuyama Ryo、Qin Xin、Komori Hisato、Kaneko Hitomi、Matsuo Yuki、Yoshida Noriaki、Komori Toshihisa
    • Journal Title

      International Journal of Molecular Sciences

      Volume: 23 Pages: 3173-3173

    • DOI

      10.3390/ijms23063173

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  • [Journal Article] Runx3 is required for oncogenic Myc upregulation in p53-deficient osteosarcoma2022

    • Author(s)
      Otani Shohei, Date Yuki, Ueno Tomoya, Ito Tomoko, Kajikawa Shuhei, Omori Keisuke, Taniuchi Ichiro, Umeda Masahiro, Komori Toshihisa, Toguchida Junya, Ito Kosei
    • Journal Title

      Oncogene

      Volume: 41 Pages: 683-691

    • DOI

      10.1038/s41388-021-02120-w

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    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Zfhx4 regulates endochondral ossification as the transcriptional platform of Osterix.2021

    • Author(s)
      Nakamura E., Hata K., Takahata Y., Kurosaka H., Abe M., et al
    • Journal Title

      Commun. Biol.

      Volume: 4 Pages: 1258-1258

    • DOI

      10.1038/s42003-021-02793-9

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    • Author(s)
      Takahata Yoshifumi、Hagino Hiromasa、Kimura Ayaka、Urushizaki Mitsuki、Kobayashi Sachi、Wakamori Kanta、Fujiwara Chika、Nakamura Eriko、Yu Kayon、Kiyonari Hiroshi、Bando Kana、Murakami Tomohiko、Komori Toshihisa、Hata Kenji、Nishimura Riko
    • Journal Title

      Communications biology

      Volume: 4 Pages: 1199-1199

    • DOI

      10.1038/s42003-021-02717-7

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    • Author(s)
      Mishima Sayaka、Takahashi Katsu、Kiso Honoka、Murashima-Suginami Akiko、Tokita Yoshihito、Jo Jun-Ichiro、Uozumi Ryuji、Nambu Yukiko、Huang Boyen、Harada Hidemitsu、Komori Toshihisa、Sugai Manabu、Tabata Yasuhiko、Bessho Kazuhisa
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 11 Pages: 13674-13674

    • DOI

      10.1038/s41598-021-93256-y

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    • Author(s)
      Qin Xin、Jiang Qing、Komori Hisato、Sakane Chiharu、Fukuyama Ryo、Matsuo Yuki、Ito Kosei、Miyazaki Toshihiro、Komori Toshihisa
    • Journal Title

      Journal of Bone and Mineral Research

      Volume: 36 Pages: 2081-2095

    • DOI

      10.1002/jbmr.4386

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  • [Journal Article] Dmrt2 promotes transition of endochondral bone formation by linking Sox9 and Runx22021

    • Author(s)
      Ono Koichiro、Hata Kenji、Nakamura Eriko、Ishihara Shota、Kobayashi Sachi、Nakanishi Masako、Yoshida Michiko、Takahata Yoshifumi、Murakami Tomohiko、Takenoshita Seiichi、Komori Toshihisa、Nishimura Riko、Yoneda Toshiyuki
    • Journal Title

      Commun Biol.

      Volume: 4 Pages: 1-13

    • DOI

      10.1038/s42003-021-01848-1

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  • [Journal Article] Osteocalcin is necessary for the alignment of apatite crystallites, but not glucose metabolism, testosterone synthesis, or muscle mass2020

    • Author(s)
      Moriishi Takeshi、Ozasa Ryosuke、Ishimoto Takuya、Nakano Takayoshi、Hasegawa Tomoka、Miyazaki Toshihiro、Liu Wenguang、Fukuyama Ryo、Wang Yuying、Komori Hisato、Qin Xin、Amizuka Norio、Komori Toshihisa
    • Journal Title

      PLoS Genet .

      Volume: 16 Pages: 1008586-1008586

    • DOI

      10.1371/journal.pgen.1008586

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    • Author(s)
      Matsuura Viviane K. S. Kawata、Yoshida Carolina Andrea、Komori Hisato、Sakane Chiharu、Yamana Kei、Jiang Qing、Komori Toshihisa
    • Journal Title

      International Journal of Molecular Sciences

      Volume: 21 Pages: 2682-2682

    • DOI

      10.3390/ijms21082682

    • NAID

      120006988234

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    • Author(s)
      Xin Qin, Qing Jiang, Kenichi Nagano, Takeshi Moriishi, Toshihiro Miyazaki, Hisato Komori, Kosei Ito, Klaus von der Mark, Chiharu Sakane, Hitomi Kaneko, Toshihisa Komori
    • Journal Title

      PLOS Genetics

      Volume: 16

    • NAID

      120006980742

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    • Author(s)
      Toshihisa Komori
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      Volume: 21 Pages: 7513-7513

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      Takeshi Moriishi, Toshihisa Komori
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      PLoS Genet.

      Volume: 16

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      Toshihisa Komori
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      Volume: 21 Pages: 4161-4161

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      Toshihisa Komori
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      Volume: 62 Pages: 223-227

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    • Author(s)
      Katsutoshi Hirose, Takuya Ishimoto, Yu Usami, Sunao Sato, Kaori Oya, Takayoshi Nakano, Toshihisa Komori, Satoru Toyosawa
    • Journal Title

      Bone

      Volume: 138 Pages: 115414-115414

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    • Author(s)
      Jiang Qing、Qin Xin、Yoshida Carolina Andrea、Komori Hisato、Yamana Kei、Ohba Shinsuke、Hojo Hironori、Croix Brad St.、Kawata-Matsuura Viviane K. S.、Komori Toshihisa
    • Journal Title

      International Journal of Molecular Sciences

      Volume: 21 Pages: 2425-2425

    • DOI

      10.3390/ijms21072425

    • NAID

      120006988225

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  • [Journal Article] Osteocalcin is necessary for the alignment of apatite crystallites, but not glucose metabolism, testosterone synthesis, or muscle mass.2020

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      Moriishi T, Ozasa R, Ishimoto T, Nakano T, Hasegawa T, Miyazaki T, Wenguang L, Fukuyama R, Yuying W, Komori H, Qin X, Amizuka N, Komori T
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      Volume: -

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      120006988234

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    • Journal Title

      Int J Mol Sci.

      Volume: 21 Pages: 2425-2425

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      120006988225

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      Volume: 20 Pages: 1694-1694

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      Nakatomi C, Nakatomi M, Matsubara T, Komori T, Doi-Inoue T, Ishimaru N, Weih F, Iwamoto T, Masuda M, Kokabu S, Jimi E
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      Miyazaki Toshihiro、T. Baba Tomomi、Mori Masako、Komori Toshihisa
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      ACTA HISTOCHEMICA ET CYTOCHEMICA

      Volume: 51 Issue: 6 Pages: 185-190

    • DOI

      10.1267/ahc.18030

    • NAID

      130007535935

    • ISSN
      0044-5991, 1347-5800
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    • Author(s)
      Kawane Tetsuya、Qin Xin、Jiang Qing、Miyazaki Toshihiro、Komori Hisato、Yoshida Carolina Andrea、Matsuura-Kawata Viviane Keiko dos Santos、Sakane Chiharu、Matsuo Yuki、Nagai Kazuhiro、Maeno Takafumi、Date Yuki、Nishimura Riko、Komori Toshihisa
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 8 Pages: 13551-13551

    • DOI

      10.1038/s41598-018-31853-0

    • NAID

      120006987946

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  • [Journal Article] Runx2, an inducer of osteoblast and chondrocyte differentiation2018

    • Author(s)
      Komori T
    • Journal Title

      Histochemistry and Cell Biology

      Volume: 印刷中 Pages: 313-323

    • DOI

      10.1007/s00418-018-1640-6

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      2018 Annual Research Report
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    • Author(s)
      Saito K, Takahashi K, Huang B, Asahara M, Kiso H, Togo Y, Tsukamoto H, Mishima S, Nagata M, Iida M, Tokita Y, Asai M, Shimizu A, Komori T, Harada H, MacDougall M, Sugai M, Bessho K.
    • Journal Title

      Sci Rep

      Volume: 8 Pages: 5169-5169

    • DOI

      10.1038/s41598-018-23515-y

    • NAID

      120006545187

    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Presentation] Osteocalcin is required for bone quality but not for glucose metabolism, testosterone synthesis, or muscle mass.2021

    • Author(s)
      Komori Toshihisa
    • Organizer
      Center for Skeletal Research Inter-Organ Communication Series
    • Related Report
      2021 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] What is a real function of osteocalcin? 2019 International Symposium2019

    • Author(s)
      Komori,T
    • Organizer
      Tokyo Dental college Research Branding
    • Related Report
      2019 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Osteocalcin is required for the alignment of biological apatite crystallites but not for the regulation of bone quantity, glucose metabolism, testosterone synthesis, and muscle mass.2019

    • Author(s)
      Komori,T
    • Organizer
      The 22nd International RUNX Conference
    • Related Report
      2019 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Osteocalcin is required for the alignment of biological apatite crystallites but not for the regulation of bone formation, glucose metabolism testosterone synthesis, and muscle mass.2019

    • Author(s)
      Komori T, Ozasa R, Ishimoto T, Nakano T, Moriishi T
    • Organizer
      ECTS 2019
    • Related Report
      2019 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 特別講演「Runx2による骨格形成制御機構」2019

    • Author(s)
      小守壽文
    • Organizer
      第124回日本日本解剖学会全国学術集会
    • Related Report
      2019 Annual Research Report
  • [Presentation] Runx2と歩んだ骨代謝研究2019

    • Author(s)
      小守壽文
    • Organizer
      第37回日本骨代謝学会学術集会
    • Related Report
      2019 Annual Research Report
  • [Presentation] 象牙質形成におけるゴルジ体キナーゼFam20Cの役割。2019

    • Author(s)
      廣瀬勝俊,宇佐美悠,大家香織,小守壽文,豊澤悟
    • Organizer
      第37回日本骨代謝学会学術集会
    • Related Report
      2019 Annual Research Report
  • [Presentation] Runx2による骨格形成制御機構2019

    • Author(s)
      小守 壽文
    • Organizer
      第124回日本日本解剖学会全国学術集会
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] Runx2による骨芽細胞分化・増殖の制御機構2018

    • Author(s)
      小守 壽文
    • Organizer
      第36回日本骨代謝学会学術集会
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
  • [Presentation] オステオカルシンはアパタイト結晶のコラーゲン線維に沿った配向に必須であり、長軸方向の骨強度を維持する2018

    • Author(s)
      森石武史,小笹良輔,中野貴由,宮崎敏博,小守壽文
    • Organizer
      第36回日本骨代謝学会学術集会
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
  • [Presentation] Runx2は骨芽細胞分化後の骨基質蛋白質遺伝子発現に必要である2018

    • Author(s)
      姜晴,秦昕,宮崎敏博,福山亮,小守寿人,森石武史,伊藤公成,小守壽文
    • Organizer
      第36回日本骨代謝学会学術集会
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
  • [Presentation] Runx2による頭蓋冠形成制御機構2018

    • Author(s)
      秦昕,姜晴,宮崎敏博,森石武史,小守寿人,小守壽文
    • Organizer
      第36回日本骨代謝学会学術集会
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
  • [Presentation] 骨形成におけるゴルジ体キナーゼFam20Cの役割2018

    • Author(s)
      廣瀬勝俊,宇佐美悠,佐藤淳,大家香織,小守壽文,豊澤悟
    • Organizer
      第36回日本骨代謝学会学術集会
    • Related Report
      2018 Annual Research Report

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Published: 2018-06-12   Modified: 2022-12-28  

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