Establishment of a novel strategy for pathological analysis of multifactorial diseases using genetic risk variants
| Project/Area Number |
18H05285
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Broad Section I
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
山本 一彦 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, チームリーダー (80191394)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 亜香里 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, 副チームリーダー (00391996)
庄田 宏文 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (20529036)
尾崎 浩一 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター, メディカルゲノムセンター, 部長 (50373288)
寺尾 知可史 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, チームリーダー (60610459)
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| Project Period (FY) |
2018-06-11 – 2023-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2021)
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| Budget Amount *help |
¥193,440,000 (Direct Cost: ¥148,800,000、Indirect Cost: ¥44,640,000)
Fiscal Year 2021: ¥37,960,000 (Direct Cost: ¥29,200,000、Indirect Cost: ¥8,760,000)
Fiscal Year 2020: ¥37,960,000 (Direct Cost: ¥29,200,000、Indirect Cost: ¥8,760,000)
Fiscal Year 2019: ¥37,960,000 (Direct Cost: ¥29,200,000、Indirect Cost: ¥8,760,000)
Fiscal Year 2018: ¥41,600,000 (Direct Cost: ¥32,000,000、Indirect Cost: ¥9,600,000)
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| Keywords | QTL解析 / 免疫細胞分画 / 疾患関連遺伝子多型 / 遺伝子発現量解析 / プロモーターエンハンサー解析 / 遺伝子多型 / マルチオミクス解析 / eQTL解析 / クロマチン構造解析 / クロマチンステイタス解析 / 多因子性疾患 / 一塩基多型 / ホールトランスクリプトーム解析 / オミックス / エピゲノム解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
健常人ボランティアから50mlの末梢血を採取し、単核球（PBMC）に分離し、25種類のサブセットに分離した。それらから、RNAを抽出し、発現RNA測定のためのRNA-seq法、オープンクロマチンの検出のためのATAC-seq法、5’末の転写開始点を正確に検出するためのCAGE法に向けた処理をして、それぞれ次世代シークエンサーにてシグナルを解析した。一方、一部のPBMCよりDNAを採取し、アジア人向けに開発されたマイクロアレイで一塩基多型を解析した。RNA-seq, ATAC-seq, CAGEにて得られたシグナルをリファレンスゲノムにマッピングし、免疫が関与する種々の疾患リスクゲノム多型との関係を、発現に関する量的形質遺伝子座（eQTL）解析を並行して行いながらそれらを統合し、リスク多型が特定の免疫担当細胞サブセット特異的な機能変化に及ぼしている遺伝子領域を特定している。eQTL解析に加えて、CAGEを導入するにあたり、予備的研究として、以前解析に使用した健常人100名の５サブセット（CD4, B細胞など）のCAGE解析を行い、細胞サブセット別のプロモーターQTL解析、エンハンサーQTL解析が可能であることを確認した。例えば、１２番染色体のSNPであるrs2617170はベーチェット病の関連多型との報告があった。さらにrs2617170がこの領域でもっとも関連が強いことから責任多型と考えられていたが、そのメカニズムは不明であった。今回のCAGE解析で、CD8陽性細胞において、この部位より1000塩基離れた場所に転写開始点（TSS: transcription start site）が観察され、そのシグナル部位の多型が、遺伝子KLRC4(killer cell lectin like receptor C4)のTSSとしてのeQTLであることが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2018年度末にセルソーターのトラブルにより、一部遅れが発生したが、2019年度にはそれを解消し、2020年3月現在、健常人サンプルの採取は70名分の25サブセットの回収を進め、これらの検体はRNA-seq, ATAC-seqにて得られたシグナルをリファレンスゲノムにマッピングするところまで進んでおり、おおむね予定通りに進んでいる。1年半程度で200検体を検討中である。現在のプロトコルではおおよそ50mlの採血から単核球を分離後、2台のセルソーターを使い、27の各リンパ球サブセットに分離した場合、各サブセット毎の細胞数は平均で１－２万となることが判明している。細胞数は、RNA-seq, ATAC-seqに加えて CAGE－Seqの解析に使用した場合、現在のプロトコールではCAGE-Seqに必要なRNA量は50ngであり、十分ではない。そのため、同センターの理研-IFOMがんゲノミクス連携研究チーム（村川泰裕チームリーダー）と共同研究を開始し、試行錯誤の上、PCR法を組み合わせることで、きちんとしたシグナルを検出するプロトコールを立ち上げ、現在実際の検体で十分な情報量のデータを得ることができるかどうか検証を行っている。さらに、理研-IFOMがんゲノミクス連携研究チームでは、昨年、NET-CAGEという新しいCAGE法を開発しており、（Hirabayashi S. et al. Nat Genet 2019）この手法では、新しく合成している最中の「Nascent RNA」に着目し、Nascent RNAを迅速かつ高精度で検出することができる。そこで我々の研究にもこの手法を取り入れ、特にエンハンサー部位の詳細な解析に応用することを開始した。
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| Strategy for Future Research Activity |
近年、多因子疾患のリスク多型の多く(およそ80%)はプロモーターやエンハンサーなどの遺伝子発現調節領域にあると考えられるようになり、これらは発現に関する量的形質遺伝子座 (expression Quantitative Trait Locus: eQTL)であることが明らかになっている。プロモーターとエンハンサー解析を強力に推進するため、より少量のサンプルからのライブラリ調整を行う必要があり、共同研究グループとの連携によりプロトコールを開発している。
これまでの解析により全体の解析手法がきちんと動くことが判明しているので、さらにメカニズム解析として、この多型領域の転写因子結合解析、プロモーターエンハンサー解析に加えて、ゲノムの３次元立体構造を明らかにするHi-C解析の準備にも取り掛かっている。さらにCRISPR/Cas9を用いた変異導入解析などを行うことで、より詳細な疾患に関与する因子の研究を進めていきたい。上記の研究計画は、それぞれのサブセットを定常状態のままで解析しているが、それぞれのサブセット別に細胞を刺激することで、より病態に近いクロマチン状態とともに遺伝子多型と遺伝子発現の関係が明らかになると考えられ、その方向の研究を構築している。
また、現在の研究内容は、シングル細胞における解析ではほとんど検出できないシグナルを扱うため、リンパ球集団を解析対象としているが、研究途中でシングル細胞での解析を加えるメリットがあれば、できる限りこれも加えた研究も行いたいと考えている。
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Report
(4 results)
Research Products
(18 results)
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[Journal Article] PLD4 is a genetic determinant to systemic lupus erythematosus and involved in murine autoimmune phenotypes2019
Author(s)
Akizuki S, Ishigaki K, Kochi Y, Law SM, Matsuo K, Ohmura K, Suzuki A, Nakayama M, Iizuka Y, Koseki H, Ohara O, Hirata J, Kamatani Y, Matsuda F, Sumida T, Yamamoto K, Okada Y, Mimori T, Terao C.
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Journal Title
Annals of the Rheumatic Diseases
Volume: 78
Pages: 509-518
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Identification of U11snRNA as an endogenous agonist of TLR7-mediated immune pathogenesis.2019
Author(s)
Negishi H, Endo N, Nakajima Y, Nishiyama T, Tabunoki Y, Nishio J, Koshiba R, Matsuda A, Matsuki K, Okamura T, Negishi-Koga T, Ichinohe T, Takemura S, Ishiwata H, Iemura SI, Natsume T, Abe T, Kiyonari H, Doi T, Hangai S, Yanai H, Fujio K, Yamamoto K, Taniguchi T.
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Journal Title
Proc Natl Acad Sci U S A.
Volume: 116
Pages: 23653-23661
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Risk prediction models for dementia constructed by supervised principal component analysis using miRNA expression data2019
Author(s)
Shigemizu D, Akiyama S, Asanomi Y, Boroevich KA, Sharma A, Tsunoda T, Matsukuma K, Ichikawa M, Sudo H, Takizawa S, Sakurai T, Ozaki K, Ochiya T, Niida S.
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Journal Title
Communications Biology
Volume: 2
Pages: 77-77
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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