バキュロウイルスによる宿主行動操作の神経基盤の解明

Research Project

Project/Area Number	18J00134
Research Category	Grant-in-Aid for JSPS Fellows
Allocation Type	Single-year Grants
Section	国内
Research Field	Insect science
Research Institution	Kanazawa University
Research Fellow	國生龍平金沢大学, 理工研究域生命理工学系, 特別研究員(PD)
Project Period (FY)	2018-04-25 – 2021-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2020)
Budget Amount *help	¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000) Fiscal Year 2020: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2019: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2018: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Keywords	宿主操作 / バキュロウイルス / カイコ / BmNPV / Bombyx mori / ゲノム編集 / CRISPR/Cas13d / GAL4-UAS / Cas13d
Outline of Annual Research Achievements	バキュロウイルスに感染したチョウ目昆虫の幼虫は異常な徘徊行動を呈する。この現象はウイルスによる利己的な宿主操作であると考えられているが、その詳細な分子・神経機構はほとんど解明されていない。本研究課題は、RNA-seq解析により同定した徘徊行動中の脳で発現量が上昇あるいは低下する遺伝子（Differentially Expressed Gene: DEG）に着目し、遺伝子組換えカイコおよびバキュロウイルスを用いてDEGおよびDEG発現ニューロンの詳細な機能解析を行うことで、宿主行動操作メカニズムの全容を解明することを目標とする。初年度は、徘徊行動中の脳で発現上昇するDEG(DEGup1)についてUAS-DEGup1カイコを作出した。そこで令和1年度は、作成したUAS-DEGup1カイコをヒートショックGAL4カイコと交配させ、F1幼虫を熱ショック処理することでDEGup1遺伝子を全身で一過的に過剰発現し、行動への影響の観察を試みた。しかし、全身でDEGup1を過剰発現すると幼虫が瀕死となり行動を観察できなかったため、ノックインによる神経細胞特異的GAL4系統の作出を進めている。また、使用したヒートショックGAL4カイコでは中枢神経系でGal4が発現しないことが明らかになったため、中枢神経系でGAL4を発現できるヒートショックGAL4カイコを新たに作出した。また、本研究ではDEGの効率的ノックダウンを行う手段として、カイコにおけるCRISPR/Cas13dシステムの導入を試みている。昨年度作成したCas13d/gRNA発現ベクターを用いることで、カイコ培養細胞においてCas13d/gRNAは非常に高効率かつ高い特異性で標的遺伝子をノックダウンできることを実証した。現在、CRISPR/Cas13dシステムがカイコ個体においても有効なツールとなりうるか検証中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 令和1年度は、GAL4-UASによる遺伝子発現誘導システムを用いたDEGの機能解析が主要な達成目標であった。当初の計画通り、UAS-DEGカイコの作出は順調に進んでいる。しかし、当初使用を予定していたエンハンサートラップGAL4カイコや、既存のヒートショックGAL4カイコでは中枢神経系における遺伝子発現を誘導できないことが判明した。また、全身でDEGup1を過剰発現すると幼虫が瀕死となり行動を観察できないことが明らかになった。これらの結果を受け、中枢神経系で遺伝子発現を誘導でき、かつ組織/部位特異的な発現を可能とするGAL4カイコ系統を新規に作出する必要が生じた。今回、中枢神経系でGAL4を発現できるヒートショックGAL4カイコを新たに作出することができた。また、TAL-PITCh法によるノックイン技術を用いることで、中枢神経系特異的GAL4カイコ系統も作出中であるため、これらの新規GAL4カイコ系統を用いることで来年度はDEGの機能解析に着手できると考えている。また、今年度はカイコ培養細胞にCRISPR/Cas13dによる遺伝子ノックダウンシステムを導入し、その有効性を実証できたことは大きな進展であった。これまで、カイコではキイロショウジョウバエ等のモデル生物と比べ、RNAiやアンチセンスモルフォリノオリゴヌクレオチド等による遺伝子ノックダウンのツールが充実していなかった。CRISPR/Cas13dシステムを導入した遺伝子組換えカイコを作出することで、標的遺伝子を時期/組織特異的にノックダウンできるようになると期待される。現在、UAS-Cas13d-gRNAカイコの作出を順次進めている。来年度はカイコ個体におけるCRISPR/Cas13dシステムの有効性を実証し、DEGの機能解析に使用する予定である。
Strategy for Future Research Activity	来年度は、これまでに作出した、あるいは現在作出中のGAL4/UASカイコを組み合わせることで、ウイルス感染/非感染カイコ幼虫においてDEGを過剰発現/ノックダウンした際の行動への影響を調査する。特に、今年度新たに作出したヒートショックGAL4カイコを用いて頭部特異的にDEG発現を制御する方法を確立することは、頭部以外の部位におけるDEG発現操作の影響を排除するために重要である。また、ウイルス感染脳の免疫染色やホールマウントin situハイブリダイゼーションにより、各DEGの発現領域とウイルス感染領域との位置関係、およびその時間的変化を調査する。別のアプローチとして、ウイルス感染脳を経時的にサンプリングし、抽出液のHPLC 分析を行なうことで、徘徊行動の惹起にともなう生体アミン量の変化を定量する。変化が見られた生体アミンについては、免疫染色を行なうことで作動性ニューロンの分布を調べ、DEG発現ニューロンとの位置関係を明らかにする。また、生体アミン受容体のアゴニストやアンタゴニストを幼虫に注射し行動活性への影響を調査することで、行動操作における生体アミンの重要性を検証する。