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卵巣移行シグナルを利用した新規遺伝子改変法

Research Project

Project/Area Number 18J10121
Research Category

Grant-in-Aid for JSPS Fellows

Allocation TypeSingle-year Grants
Section国内
Research Field Aquatic bioproduction science
Research InstitutionKyoto University
Research Fellow 村上 悠  京都大学, 農学研究科, 特別研究員(DC2)
Project Period (FY) 2018-04-25 – 2020-03-31
Project Status Completed (Fiscal Year 2019)
Budget Amount *help
¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2019: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
Fiscal Year 2018: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Keywordsビテロジェニン / ゲノム編集 / メダカ / 遺伝子改変 / ノックイン / ルシフェラーゼ / 卵内輸送 / CRISPR/Cas9 system / ソノポレーション
Outline of Annual Research Achievements

前年度は卵黄タンパク質前駆体ビテロジェニン(Vtg)の部分配列(N末300 aa:以下Vtgシグナル)により、緑色蛍光タンパク質(GFP)および発光タンパク質ルシフェラーゼ(LUC)を含む外来タンパク質を卵内へ効率的に輸送できることを見出した。一方でVtgシグナルでは最終目的とするゲノム編集ツール(Cas9)を含めた融合タンパク質(Cas9: GFP)を卵内へ送達できなかったため、Vtgの全長配列を用いることで輸送効率の向上を図った。具体的にはゲノム編集技術CRISPR/Cas9 systemを駆使し、Vtgの終止コドンの直前にCas9: GFP: polyAをノックインしたメダカを作出した。
系統化を完了した後、本ノックインメダカについて蛍光観察を行うと、肝臓で明瞭な緑色蛍光が観察された。加えて、本メダカが産出した全ての卵においても明瞭かつ均一な緑色蛍光を確認できた。Vtgシグナルによって本融合タンパク質の輸送を試みた際は、卵内で緑色蛍光が見られなかったため、本結果は全長配列の利用によって狙い通り輸送効率の改善に成功したことを示す。続いて卵内でのCas9のヌクレアーゼ活性を評価するため、標的遺伝子(slc45a2; 黒色色素の合成に関連)を認識するsgRNAを受精卵内へ顕微注入した。注入卵はHeteroduplex mobility assay(HMA)解析によってslc45a2の変異の有無を確認したが、いずれのサンプルからも変異活性を示す結果は得られなかった。この原因としては、Cas9が卵内へ流入する前後で分解されたこと、あるいは卵内でのCas9の蓄積量が不足していること等が考えられる。Vtgは卵内に取り込まれた後、複数のドメインごとに限定分解されることが既知である。したがって各ドメイン間にCas9: GFP: polyAをノックインすることでこの現状の打開を図っている。

Research Progress Status

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Report

(2 results)
  • 2019 Annual Research Report
  • 2018 Annual Research Report

Research Products

(10 results)

All 2020 2019 2018

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Presentation (9 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results)

  • [Journal Article] Development of an efficient bioreactor system for delivering foreign proteins secreted from liver into eggs with a vitellogenin signal in medaka Oryzias latipes.2019

    • Author(s)
      Yu Murakami, Tomohisa Horibe, Masato Kinoshita
    • Journal Title

      Fisheries science.

      Volume: 印刷中

    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Presentation] A partial sequence of vitellogenin enables to transport and accumulate foreign proteins into eggs in medaka Oryzias latipes.2020

    • Author(s)
      Yu Murakami, Tomohisa Horibe, Masato Kinoshita
    • Organizer
      Aquaculture America 2020
    • Related Report
      2019 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Cas9ニッカーゼを用いた致死遺伝子に対するノックイン法の開発2020

    • Author(s)
      村上悠, 木下政人
    • Organizer
      令和2年度日本水産学会春季大会
    • Related Report
      2019 Annual Research Report
  • [Presentation] ビテロジェニンシグナルを利用した卵への外来タンパク質輸送システムの開発2019

    • Author(s)
      村上悠, 堀部智久, 木下政人
    • Organizer
      令和元年度日本水産学会秋季大会
    • Related Report
      2019 Annual Research Report
  • [Presentation] Establishment of a novel bioreactor system for transporting and accumulating foreign proteins in eggs with a vitellogenin signal in medaka Oryzias latipes.2019

    • Author(s)
      Yu Murakami, Tomohisa Horibe, Masato Kinoshita
    • Organizer
      Marine biotechnology conference 2019
    • Related Report
      2019 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 卵内物質輸送を可能とするモデルメダカの作出2018

    • Author(s)
      村上 悠、木下 政人
    • Organizer
      第20回 マリンバイオテクノロジー学会 宮崎大会
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
  • [Presentation] 卵内物質輸送を可能とするモデルメダカの作出2018

    • Author(s)
      村上 悠
    • Organizer
      平成30年度 日本水産学会近畿支部前期例会 シンポジウム
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
  • [Presentation] 卵内物質輸送を可能にするモデルメダカの作出2018

    • Author(s)
      村上 悠、木下 政人
    • Organizer
      平成30年度 日本水産学会春季大会
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
  • [Presentation] メダカにおける時空間制御型遺伝子ノックアウト法の開発2018

    • Author(s)
      村上 悠、安齋 賢、坂本 丞、木下 政人
    • Organizer
      平成30年度 日本水産学会近畿支部後期例会
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
  • [Presentation] 遺伝子導入メダカ作出による卵内物質輸送システムの確立2018

    • Author(s)
      村上 悠、堀部 智久
    • Organizer
      日本動物学会 第89回 2018札幌大会(震災により東京で開催)
    • Related Report
      2018 Annual Research Report

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Published: 2018-05-01   Modified: 2021-01-27  

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