β－ｃａｔｅｎｉｎ変異がんに対する合成致死誘導機構の解析
| Project/Area Number |
18J13151
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Research Field |
Biomolecular chemistry
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| Research Institution | Keio University |
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| Research Fellow |
池田 拓慧 慶應義塾大学, 理工学研究科, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2020-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2019)
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| Budget Amount *help |
¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
Fiscal Year 2019: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2018: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
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| Keywords | ケミカルバイオロジー / β-catenin / 合成致死 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではケミカルバイオロジーの手法を用いてβ-catenin変異がん細胞に対する合成致死誘導機構を解明する．これまでに申請者らはβ-catenin変異がん細胞に選択的に細胞死を誘導する化合物としてSLBC-2を見出していた．そこで，SLBC-2の細胞死誘導機序を解明することで合成致死の機構を明らかにすることを研究の目的とした．
これまでにSLBC-2が変異β-cateninに依存した細胞死を誘導することを見出していたが，その標的タンパク質は不明であった．平成30年度ではSLBC-2化合物ビーズを用いて結合タンパク質の取得を試みた．細胞抽出液とSLBC-2ビーズを混合しプルダウンしたところ，SLBC-2特異的な結合タンパク質は取得できなかった．そこで，細胞分画を行いミトコンドリア画分とプルダウンすることによって，SLBC-2結合タンパク質の取得に成功した．
SLBC-2結合タンパク質がミトコンドリアタンパク質であることが示唆されたことから，SLBC-2処理によってミトコンドリア障害が誘導されるか検討した．ミトコンドリア膜電位をフローサイトメーターを用いて検出したところ，ミトコンドリア機能が障害されることが分かった．また，siRNAを用いて結合タンパク質をノックダウンしたところSLBC-2処理同様にミトコンドリア障害が誘導されたことから，SLBC-2がミトコンドリアを標的としていることが示唆された．
SLBC-2の作用機構を解析するにあたり，細胞死シグナルとして広く知られているcaspase依存的な細胞死であるかを検討した．その結果，caspase阻害剤を処理してもSLBC-2による細胞死は抑制できなかったことから，現在caspase非依存的な細胞死誘導経路の関与について検討を行なっている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の平成30年度予定であったSLBC-2結合タンパク質を取得するために，化合物ビーズと反応させる細胞内タンパク質の抽出手法やビーズとの反応条件を検討した．その結果，細胞内の総タンパク質を抽出しビーズと反応させても結合タンパク質の検出が困難であることが分かった．そこで細胞分画を行うことで各細胞内小器官を濃縮し，再度プルダウン実験を実施したところ，ミトコンドリアタンパク質を濃縮した画分にて結合タンパク質を見出した．また，その結合タンパク質のノックダウンおよびSLBC-2処理によりミトコンドリア障害が誘導されることを見出した．
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| Strategy for Future Research Activity |
SLBC-2標的タンパク質または作用標的に関与するタンパク質について，siRNAを導入しノックダウンすることで細胞死が誘導されるか，またプラスミドを作成し過剰発現させることでSLBC-2の効果が減弱するか確認し，真に変異β-cateninに対する合成致死標的であるか実証する．結合タンパク質がミトコンドリアタンパク質であることから，SLBC-2処理によってミトコンドリア障害が誘導されるか検出する．
続いて，SLBC-2および標的タンパク質のノックダウンによる細胞死のシグナル機構を解析する．Caspase阻害剤によって細胞死が阻害されなかったことから，caspase非依存的細胞死経路として知られるAIF経路に注目し，ミトコンドリア内AIFの細胞質放出および核内移行を検出する．標的タンパク質の結果と合わせSLBC-2による細胞死シグナル伝達の全容を明らかにする．
遺伝的背景の異なる多種がん細胞株に対してSLBC-2を処理し感受性プロファイルを取得し，さらに動物モデルを用いて抗腫瘍活性を検討することで，変異β-cateninに対する合成致死性および作用標的の妥当性、薬理活性を評価する．
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Report
(1 results)
Research Products
(6 results)
