キノン補酵素形成機構の解明およびペプチド修飾酵素による機能性環状ペプチドの創出
| Project/Area Number |
18J22104
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
|
| Allocation Type | Single-year Grants |
|---|
| Section | 国内 |
|---|
| Research Field |
Applied biochemistry
|
|---|
| Research Institution | Osaka University |
|---|
| Research Fellow |
大関 俊範 大阪大学, 理学研究科, 特別研究員(DC1)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2020)
|
| Budget Amount *help |
¥2,800,000 (Direct Cost: ¥2,800,000)
Fiscal Year 2020: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2019: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2018: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
|
|---|
| Keywords | ビルトイン型補酵素 / 翻訳後修飾 / セリンプロテアーゼ |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
キノヘムプロテイン・アミン脱水素酵素(QHNDH)の活性中心を形成する9 kDaのサブユニットQhpCには、キノン補酵素システイントリプトフィルキノン(CTQ)を含む２種類のユニークな翻訳後修飾構造が存在し、3つの修飾酵素が関与する多段階ステップによって生合成される。これまでの解析の結果、まず、細胞質内でラジカルSAM酵素QhpDがAsp/Glu残基とCys残基との間に3ヶ所の分子内チオエーテル架橋を形成し、次にFAD依存性水酸化酵素QhpGが前駆体Trp残基のインドール環を水酸化し、CTQ形成の初発反応を行うと考えている。その後、QhpDとの相互作用に必要であったQhpCのN末端28残基のリーダーペプチドは、サブチリシン様セリンペプチダーゼQhpEによって除去される。QhpEについては、Ps. putida QhpEの発現系を構築して、QhpCに対する反応性を解析した。まず、QhpC/QhpD/QhpG複合体を基質としてQhpEと混合し、反応生成物をMALDI-TOF-MS解析したところ、架橋形成QhpCではリーダーペプチドが切断されたのに対して、未架橋QhpCでは、リーダーペプチドが切断されていないものも観測された。QhpC/QhpD/QhpG複合体の状態では、未架橋より架橋形成したQhpCの方が反応性が高いことがわかった。次に、QhpEとQhpCを混合し、終夜反応物をMALDI-TOF-MS解析したところ、複合体を形成していない単独の場合では、QhpEはQhpCの架橋形成の有無に関わらず、リーダーペプチドを切断することがわかった。さらにQhpEの詳細な反応速度を調べるため、リーダーペプチドの解離の時間経過を観測したところ、架橋QhpCでは未架橋QhpCに比べて、QhpEに対する反応速度が大幅に上昇していることがわかった。また、基質フリーのQhpEの結晶化にも成功した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
QHNDHの活性中心を形成するQhpCの翻訳後修飾には、3つの修飾酵素が関与する多段階ステップによって生合成される。これまでに、翻訳されたQhpCは、QhpDおよびQhpGと三者複合体を形成し、QhpDによって3ヶ所のチオエーテル架橋が形成される。その後、同一複合体上で、QhpGによってCTQ前駆体Trp残基側鎖インドール環が二重水酸化されることを明らかにしてきた。本年度では、リーダーペプチドを切断すると予想されるQhpEの機能解析を行った。QhpC/QhpD/QhpG複合体を基質としてQhpEと反応させた結果、複合体の状態では、未架橋より架橋形成したQhpCの方が反応性が高いことがわかった。また、QhpD/QhpC複合体あるいはQhpCを基質としてQhpEと反応させた結果、QhpCの架橋形成の有無に関わらず、リーダーペプチドを切断することがわかった。QhpEとQhpCの複合体形成能を調べるため、Native PAGEを行ったところ、活性中心Ser残基を破壊したQhpE変異体(S180A)では、未架橋QhpCよりも架橋形成QhpCとの間に強い相互作用が観測された。すなわち、QhpEはQhpCの架橋形成構造を認識し、その活性が制御されていることが判明した。これらの結果からQhpC/QhpD/QhpG複合体の状態では未架橋QhpCの場合、複合体の内部に埋もれており、QhpEがQhpCを認識できずリーダーペプチドを切断できないのに対して、架橋QhpCは複合体の外に露出することでQhpEとのアクセスが可能となり、リーダーペプチドが切断されるのではないかと示唆される。QhpCの架橋形成とCTQ形成初発反応にはリーダーペプチドを必要とするため、このようなQhpEの反応性は、翻訳されたばかりの未架橋QhpCのリーダーペプチドが素早く切断されるのを防ぐことに役立っていると考えられた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
本研究では、QHNDHのチオエーテル架橋形成に関与するQhpD、およびCTQ形成に関与するQhpGなど、QhpCの翻訳後修飾に関与する酵素の反応メカニズムを詳細に理解した上で、そのユニークな修飾酵素を用いた機能性ペプチドの創出が実現できれば、新たな医薬品を創り出すツールにもなり得る。本研究の成果を新規性の高い医薬品や抗菌剤の開発につなげることが最終目標である。本年度は、QhpEやQhpE/QhpC複合体、QhpG/QhpC複合体の結晶構造解析を行い、詳細な基質認識機構を調べる。また、QhpDの結晶構造解析を行い、詳細なチオエーテル架橋形成機構の解析を行う。さらに、QhpDを用いて機能性環状ペプチドの創出を試みる。方法としては、araBAD プロモーター支配下で厳密な発現制御が可能なベクターに、QhpDのみをクローニングしておく。QhpDをアラビノース添加によって発現誘導したときのみ、大腸菌が死滅することを指標に、環状化抗菌ペプチドの取得を目指す。なお、リーダーペプチドの除去が必要と考えられる場合には、それに関与するプロテアーゼQhpEも共発現させる。
|
Report
(1 results)
Research Products
(5 results)
