クロマチン制御因子TAF-Iによるヒトテロメアの構造と機能の制御機構

• Project/Area Number: 18K06052
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 43010:Molecular biology-related
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 加藤 広介 筑波大学, 医学医療系, 助教 (90466673)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2018)
• Budget Amount: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2020: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2019: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000); Fiscal Year 2018: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: テロメア / テロメラーゼ / エピジェネティクス / TAF-I / クロマチン / 染色体安定性

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題では、哺乳類細胞のクロマチン制御因子TAF-Iによるテロメアの構造と機能の制御機構を解明することを目的とし、（１）TAF-Iによるテロメラーゼ酵素サブユニットTERT遺伝子のエピジェネティックな発現制御機構と、（２）TAF-IによるテロメアDNA-タンパク質複合体を介したテロメア機能の制御機構の2つについて解明を目指している。
平成30年度は、（１）のTAF-IによるTERT遺伝子発現制御機構の解明を中心に研究を進めた。siRNAの発現により、TAF-Iの発現量が低下したヒト子宮頸がん由来のHeLa細胞(TAF-I KD細胞）では野生型の細胞に比較してTERTのmRNAレベルおよびタンパク質（テロメラーゼ酵素活性）レベルでの減少が確認された。TERT mRNAは半減期が短く、mRNAの分解によっても発現が調節されるが、野生型細胞とTAF-I KD細胞の間でTERT mRNAの半減期に違いは観察されなかった。次に、ヒトTERT遺伝子座のプロモーター領域をルシフェラーゼに連結したレポーター遺伝子を用いて、TAF-I KDのTERTプロモーター活性への影響を調べた。しかし、TAF-I KD細胞でレポーター遺伝子の発現低下は観察されなかった。そこで、TERTプロモーター領域に存在するCpGアイランドのメチル化状態を調べたところ、TAF-I KD細胞でTERT遺伝子座の転写開始点周辺のDNAメチル化のレベルが亢進している様子が観察された。また、クロマチン免疫沈降によりヒストン修飾状態を調べたところ、転写活性化状態のマーカーであるヒストンH3のアセチル化とK4トリメチル化がTAF-I KD細胞で有意に減少していた。以上の結果より、TAF-IはTERT遺伝子のエピジェネティックな転写制御を介してテロメラーゼの発現を正に制御することが明らかとなった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初年度である平成30年度は、TAF-Iによるテロメラーゼ酵素サブユニットTERT遺伝子の発現制御機構を解明することを目的としていた。これまでにTAF-Iの発現低下により、TERT遺伝子プロモーター領域のCpGアイランドでDNAメチル化が亢進すること、転写活性化マーカーであるヒストン修飾が低下することを見出しており、TAF-Iがエピジェネティックな転写制御を介してTERTの発現制御に関わることを明らかとした。これより、当初の研究計画どおりおおむね順調に進展していると考えている。しかし、詳細なメカニズムに関しては現在まで明らかでない。ヒストンH!はDNAメチル化酵素を遺伝子上にリクルートして転写抑制に関与することが明らかとなっている。申請者はこれまでにTAF-IがヒストンH1シャペロンとしてヒストンH1を介してクロマチン構造制御に関わることを見出していたため、TAF-Iの発現低下によりTERT遺伝子座でのヒストンH1の量または質的な変化が起こると想定していた。しかし、実際には野生型細胞とTAF-I KD細胞間でTERT遺伝子プロモーター上のヒストンH1の結合状態にほとんど差は見られなかった。これにより、TAF-IはヒストンH1を介してではなく、まったく異なる機構でTERT遺伝子のエピジェネティックな転写制御に関与することが示唆された。これより当初の計画で想定していたより複雑な分子機構が存在すると考えられ、今後の研究計画を必要に応じて微修正しながら注意深く遂行する必要がある。

Strategy for Future Research Activity

今後の研究の推進方策として、TAF-IによるTERT遺伝子の発現制御機構に関しては、まずTAF-Iの発現抑制によりTERT遺伝子で起こるエピジェネティックな変化の時系列を明らかにする。次にTAF-Iがどのような機構でDNAメチル化の制御に関わるかを明らかとするため、DNAメチル化酵素DNMTとDNA脱メチル化に関わるTETファミリータンパク質に着目し、TAF-IがそれぞれのTERT遺伝子上での機能に与える影響を検証する。また、ヒストン修飾因子についても同様の解析を進める予定である。
また本研究のもう一つの課題であるTAF-IによるテロメアDNA-タンパク質複合体を介したテロメア機能の制御機構についても解析を進めていく。現在までテロメア特異的なDNA-タンパク質複合体（Shelterin複合体）を構成するタンパク質の一つであるTRF1については、TAF-Iが細胞内でTRF1のテロメア結合のダイナミクスを制御する可能性を見出している。今後、他のShelterin構成タンパク質のテロメア結合に対するTAF-Iの影響も検証していく。また、現在までにTRF1の組換えタンパク質の発現・精製系を確立しており、予備実験の段階であるがTAF-IとTRF1の直接的な相互作用も確認できている。今後、他のShelterin複合体構成タンパク質についても同様に組換えタンパク質を調製し、これらに対するTAF-Iの機能を生化学的に解析していく予定である。