| Project/Area Number |
18K06065
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43010:Molecular biology-related
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
上 大介 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80415588)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
秋光 信佳 東京大学, アイソトープ総合センター, 教授 (40294962)
五條 理志 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90316745)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2018)
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| Budget Amount *help |
¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2018: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | RNA metabolism / Cellular transition / FAPS / RNA-seq / LC-MS/MS |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は細胞が分化転換した際に細胞内で起きるRNA代謝がどのように代謝されているのかを解析することを目的としている。そこで分化転換のモデル細胞として、TGFB2を加えることで容易に上皮間葉転換がおきるA549細胞を用いた。またRNA代謝は実際にRNA代謝が行われているProcessing body（PB）と呼ばれるRNAとタンパク質の複合体に含まれるRNAを解析することで評価する。このPBにはDDX6と呼ばれるタンパク質が分化転換時にFociを形成することが知られている。そこで我々はDDX6タンパク質と蛍光タンパク質を融合したレトロウィルスベクターを作製し、A549細胞に導入した。
A549にEGFPを融合したDDX6をレトロウィルスにて感染し、GFP強度の高い分画をソーティングし、A549-EGFP-DDX6 high region（以下、A549EDhとする）を樹立し、single cell sortingによる細胞の純化も試みた。この細胞にTGFB2による刺激を加え、二日後に細胞を回収した。回収した細胞は既報の論文（Hubstenberger A. Mol Cell. 2017）をもとに細胞質からPBを単離し、cell sorter SH800（SONY社）によるソーティング条件を検討した。この結果、EGFP-DDX6感染させた細胞株に特異的な分画を見出すことができ、その部位の回収に成功した。回収したRNAはBioAnalyzerにてRNA純度を評価したところ、微量ながらも長鎖RNAが含まれていることが明らかとなった。現在は微量RNA-seq解析を進めており、その結果の解析を次のステップとして考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
モデル細胞（A549EDh）の作成と分化転換誘導法と評価法は確立済みでFACSを用いたPBのソーティングも上手くいっている。現在は回収したRNAサンプルをRNA-seqに外部委託先に提出しており、その解析結果を待っている。
以上のことから概ね順調に進展しており、本結果の一部は2019年度の国内学会にて発表を予定している。
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| Strategy for Future Research Activity |
PBに特異的に存在するRNAを特定し、各条件との関連を比較しながら網羅解析等の手法で決定していく。この結果をもとにFACSによるPBソーティングが上手くいっているのかを評価しつつ、生物学的な意義も決定していく。次にこの特異的なRNAをCRISPR法でKnock outし、A549の分化転換に与える影響を遺伝子発現解析等で評価する。
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