三者複合体形成型ABC輸送体MacBによる基質輸送機構の解明
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18K06079
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43020:Structural biochemistry-related
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
岡田 有意 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (20507181)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2018)
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| Budget Amount *help |
¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2018: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | 膜輸送体 / 輸送タンパク質 / X線結晶解析 / 薬剤耐性 / 構造生物学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ATPの加水分解エネルギーを利用して基質を能動輸送するATP-binding cassette (ABC)輸送体のうち、外膜チャネルと膜融合蛋白質と複合体を形成して基質の輸送を行う三者複合体形成型輸送体MacBについて、その基質輸送機構を解明することを目的としている。この輸送体MacBは、マクロライド系抗生物質やペプチド毒素、リポ多糖、プロトポルフィリン等を輸送する重要な研究対象である。これまでにMacB単独の立体構造を明らかにしてきたが、その基質輸送機構の詳細な解明には、輸送基質とMacBの複合体の立体構造情報が不可欠である。そこで、2018年度は、MacBと基質の複合体の構造解析を目指し、先行研究によってMacBの基質となることが明らかになっているいくつかの基質について、その調製をおこなった。大腸菌発現系に用いることができる発現ベクターを構築し、大量培養をおこなった。培養条件、精製条件などの検討をおこない、MacBとの複合体の結晶化条件の検討に利用可能な、高純度かつ高濃度の基質の調製に成功した。
また、輸送基質と安定な複合体を形成するように、MacBの基質輸送において、重要な役割を担っていると考えられるアミノ酸残基に変異を入れた非輸送型MacB変異体の発現ベクターを構築した。その過剰発現用ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、大量培養、調製をおこなった。今後、調製した基質との相互作用を確認し、MacBと基質複合体の結晶化条件の検討をおこなっていく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
MacBとの複合体の結晶化に向けて、先行研究で明らかとなっているMacBの基質について、高品質の標品の調製に成功した。また、すでに相互作用することが明らかとなっている基質と輸送体を用いて、基質－輸送体の相互作用を確認する実験系を確立した。この確立した実験系を用いて、調製したMacBと基質が強く相互作用する条件を検討する。今後、これらの標品を用いて、複合体の結晶化条件の探索をおこなう予定である。さらに、すでに構造解析に成功しているアシネトバクター由来のMacB以外にも、他の生物種由来のMacBホモログについて、発現系構築、調製条件の検討をおこない、より高分解能の回折が得られる良質な結晶の取得に成功した。今後、条件検討をおこない、基質複合体の構造解析を目指す。
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| Strategy for Future Research Activity |
MacBと基質が強く相互作用する条件の検討をおこない、複合体の結晶条件を探索する予定である。X線回折実験に利用可能な良質な結晶が得られない場合は、他の生物種由来のMacBホモログについても、調製の条件検討を行い、基質との複合体の結晶の取得を目指す。
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Report
(1 results)
Research Products
(2 results)
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[Journal Article] BpeB, a major resistance-nodulation-cell division transporter from Burkholderia cenocepacia: construct design, crystallization and preliminary structural analysis2018
Author(s)
T. Horikawa, L.-W. Hung, H.-B. Kim, D. Shaya, C.-Y. Kim, T. C. Terwilliger, E. Yamashita, M. Aoki, U. Okada and S. Murakami
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Journal Title
Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications
Volume: 74
Pages: 710-716
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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