ゼブラフィッシュを用いたHox遺伝子クラスターのゲノム機能解析

• Project/Area Number: 18K06177
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 43050:Genome biology-related
• Research Institution: Saitama University
• Principal Investigator: 川村 哲規 埼玉大学, 理工学研究科, 准教授 (10466691)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2020: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2019: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2018: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
• Keywords: Hox遺伝子 / CRISPR-Cas9 / 遺伝子クラスター / ゼブラフィッシュ / 脊椎動物の体軸形成 / X線CTスキャン / 多重変異体 / Hoxクラスター欠失変異体 / Hox遺伝子群 / 発生遺伝学 / 機能進化 / 脊椎動物 / 脊椎動物の前後軸 / Hoxクラスター / ゲノム構造

Outline of Annual Research Achievements

Hox遺伝子群の発見から四半世紀以上経った現在においても、その機能と制御機構については不明な点が多く残されている。その大きな理由として、Hox遺伝子群のゲノム上の構造と、それに伴う相補性の高さが挙げられる。ショウジョウバエでは、単一の染色体上に一列に並んだホメオティック遺伝子群はそれぞれ固有の機能を持ち、遺伝子と機能の相関が明確である。一方、脊椎動物においては、脊椎動物の進化の初期過程で生じた2回の全ゲノム重複により、ヒトやマウスでは4つのHoxクラスターが存在している。また、真骨魚類では4つのHoxクラスターがさらに倍加し8つのクラスターを生じた後、ゼブラフィッシュではhoxdbクラス
ターが消失して計7つのクラスター構造を有している。さらに、単一のHoxクラスター内には10個程度のHox遺伝子が並び、個々のHox遺伝子はcis及びtransに相補しあい、その結果、遺伝子と機能の関係は非常に複雑である。このように高度に相補性を持つ脊椎動物のHoxクラスターの機能と制御の全容を解明するには、ゲノムレベルでHox遺伝子クラスターを捉えた解析が必須である。本研究では、胚発生が早く、遺伝学的解析に優れたゼブラフィッシュの利点を生かし、それぞれのHox遺伝子クラスターを破壊した欠損体をCRISPR-Cas9システムを用いて作製し、脊椎動物におけるHox遺伝子クラスターの役割を解明する。さらに、Hox遺伝子
クラスターの多重変異体を作製し、その表現形解析を行うとともに各クラスターのゲノム構造を解析することにより、Hox遺伝子クラスター間の相互作用の意義を解明する。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

これまでにCRISPR-Cas9法を用いて、ゼブラフィッシュに存在する7つのhoxクラスターをそれぞれ欠失した変異体の作製に成功した。単離した7つの変異体全てについて、胚発生期における表現型を解析し、成魚まで生存した5つの変異体については、共同研究によりX線CTスキャンを用いて、全身骨格解析および軟組織解析を行った。得られた各hoxクラスター欠失変異体の表現型を、マウスの相同なHoxクラスターを欠失したノックアウトマウスで報告された知見と比較すると、機能が保存されている点や異なる点が見出され、Hoxクラスターは、脊椎動物の進化の過程で異なる機能進化を遂げたことが示唆された。本成果をまとめた論文はDevelopment誌に受理され、「論文として公表する」という昨年度の目標を達成することができた。
また並行して、今年度は、クラスター変異を重ね合わせたhoxクラスター多重欠失変異体を作製し、表現型解析を進めた。その結果、マウスでは見出されていない脊椎動物Hox遺伝子の新しい機能を示唆する様々な表現型を見出した。特に興味深い表現型については、原因となるhox遺伝子を同定するため、クラスター内の各hox遺伝子に変異を導入した変異体を作製した。現在までに、ゼブラフィッシュに存在する48個のhox遺伝子のうち、半数以上のhox遺伝子について変異体を単離し、さらに複数のhox遺伝子に変異を同時に有する変異体も作製した。その結果、hoxクラスター欠失変異体で見出された表現型の幾つかについては、クラスター内のhox遺伝子に変異体で表現型を再現することを確認でき、原因となるhox遺伝子を同定することに成功した。以上のことから、これまでに得られた成果は、当初の想定を上回るもので、当初の計画以上に進展していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

最終年度にあたる今年度は、hoxクラスター多重変異体における表現型解析とその原因遺伝子の同定を行うことを主な目標とする。そのため、様々な組合せのhoxクラスター多重変異体についてマーカー遺伝子を用いてin situ hybridizationを行い、詳細な解析を進める。さらに、これまでに見出した興味深い表現型については、原因遺伝子となるhox遺伝子群を同定し、その機能の詳細をさらに明らかにしていく。特に、既に解析が進んでいるものに関しては論文発表できるレベルまでデータを積み上げることを目標として、今年度の研究を推進していく。

Research Products

• [Journal Article] An atlas of zebrafish seven hox cluster mutants provides insights into sub/neofunctionalization of vertebrate Hox clusters. (2021)
  • Author(s): Yamada, K., Maeno, A., Kikuchi, M., Suzuki, M., Ishizaka, M., Sato, K., Akama, K., Kawabe, Y., Suzuki, K., Kobayashi, D., Hamano, N., Kawamura, A.
  • Journal Title: Development Volume: 148
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A globin-family protein, Cytoglobin 1, is involved in the development of neural crest-derived tissues and organs in zebrafish. (2021)
  • Author(s): Takahashi, K., Ito, Y., Yoshimura, M., Nikaido, M., Yuikawa, T., Kawamura, A., Tsuda, S., Kage, D., Yamasu, K.
  • Journal Title: Developmental Biology Volume: 472 Pages: 1-17
  • DOI: 10.1016/j.ydbio.2020.12.016
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The role of somite patterning in the formation of Weberian apparatus and pleural rib in zebrafish. (2020)
  • Author(s): Akama, K., Ebata, K., Maeno, A., Taminato, T., Otosaka, S., Gengyo-Ando, K., Nakai, J., Yamasu, K., Kawamura, A.
  • Journal Title: Journal of Anatomy Volume: 236 Pages: 622-629
  • DOI: 10.1111/joa.13135
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Transcriptional autoregulation of zebrafish tbx6 is required for somite segmentation (2019)
  • Author(s): Ban Hiroyuki、Yokota Daisuke、Otosaka Shiori、Kikuchi Morimichi、Kinoshita Hirofumi、Fujino Yuuri、Yabe Taijiro、Ovara Hiroki、Izuka Ayaka、Akama Kagari、Yamasu Kyo、Takada Shinji、Kawamura Akinori
  • Journal Title: Development Volume: 146 Pages: 1-11
  • DOI: 10.1242/dev.177063
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Functional roles of the Ripply-mediated suppression of segmentation gene expression at the anterior presomitic mesoderm in zebrafish (2018)
  • Author(s): Kinoshita Hirofumi、Ohgane Nanae、Fujino Yuuri、Yabe Taijiro、Ovara Hiroki、Yokota Daisuke、Izuka Ayaka、Kage Daichi、Yamasu Kyo、Takada Shinji、Kawamura Akinori
  • Journal Title: Mechanisms of Development Volume: 152 Pages: 21-31
  • DOI: 10.1016/j.mod.2018.06.001
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Deadenylation by the CCR4-NOT complex contributes to the turnover of hairy-related mRNAs in the zebrafish segmentation clock. (2018)
  • Author(s): Fujino Y, Yamada K, Sugaya C, Ooka Y, Ovara H, Ban H, Akama K, Otosaka S, Kinoshita H, Yamasu K, Mishima Y, Kawamura A.
  • Journal Title: FEBS Letters Volume: 592(20) Pages: 3388-3398
  • DOI: 10.1002/1873-3468.13261
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ゼブラフィッシュ器官形成におけるhoxcaおよびhoxcbクラスターの機能解析 (2021)
  • Author(s): 佐藤 こうみ, 鈴木賢弥, 前野 哲輝, 山田 一哉, 荒木 颯, 川村 哲規
  • Organizer: 第73回 日本動物学会関東支部会 （オンライン開催）
• [Presentation] ゼブラフィッシュhoxaa,ab,daクラスター三重欠失変異体の解析 (2021)
  • Author(s): 石坂瑞樹, 山田一哉, 菊地守道, 前野哲輝, 荒木 颯, 川村哲規
  • Organizer: 第73回 日本動物学会関東支部会 （オンライン開催）
• [Presentation] ゼブラフィッシュ遺伝学によるhoxクラスターの機能解析 (2020)
  • Author(s): 川村哲規
  • Organizer: 日本動物学会 第91回大会2020（オンライン開催）シンポジウム
• [Presentation] ゼブラフィッシュ胚発生におけるhoxbaおよびhoxbbクラスターの機能解析 (2020)
  • Author(s): 菊地守道、山田一哉、前野哲輝、荒木 颯、鈴木聖人、石坂瑞樹、小林大貴、川村哲規
  • Organizer: 日本動物学会 第91回大会2020（オンライン開催）
• [Presentation] ゼブラフィッシュhoxcaおよびhoxcbクラスターの発生遺伝学的解析 (2020)
  • Author(s): 鈴木聖人、山田一哉、前野哲輝、荒木 颯、菊地守道、石坂瑞樹、佐藤こうみ、鈴木賢弥、川村哲規
  • Organizer: 日本動物学会 第91回大会2020（オンライン開催）
• [Presentation] ゼブラフィッシュhoxbaおよびhoxbbクラスター欠失変異体の表現型解析 (2020)
  • Author(s): 菊地守道、山田一哉、前野哲輝、荒木 颯、鈴木聖人、石坂瑞樹、赤間 燿、河部由貴、小林大貴、川村哲規
  • Organizer: 第43回 日本分子生物学会年会（オンライン開催）
• [Presentation] ゼブラフィッシュ胚発生におけるhoxクラスターの機能解析 (2020)
  • Author(s): 菊地守道、山田一哉、前野哲輝、荒木 颯、鈴木聖人、石坂瑞樹、赤間 燿、川村哲規
  • Organizer: 第72回 日本動物学会関東支部会
• [Presentation] 成長に伴うゼブラフィッシュの体節間血管の再配置に関する研究 (2020)
  • Author(s): 松野由美香、乙坂栞里、鈴木聖人、川村哲規
  • Organizer: 第72回 日本動物学会関東支部会
• [Presentation] ゼブラフィッシュ成魚の全身骨格および軟組織形成におけるhoxクラスターの機能解析 (2020)
  • Author(s): 鈴木聖人、山田一哉、前野哲輝、菊地守道、荒木 颯、石坂瑞樹、赤間 燿、川村 哲規
  • Organizer: 第72回 日本動物学会関東支部会
• [Presentation] Chemical Screeningを用いたゼブラフィッシュ肋骨形成の解析 (2020)
  • Author(s): 佐藤こうみ、川村哲規
  • Organizer: 第72回 日本動物学会関東支部会
• [Presentation] Transcriptional autoregulation oftbx6 is required for the somite segmentation in zebrafish embryos (2019)
  • Author(s): Ban H, Yokota D, Otosaka S, Kikuchi M, Kinoshita H, Fujino Y, Yabe T, Ovara H, Izuka A, Akama K, Yamasu K, Takada S, Kawamura A
  • Organizer: 第25回 小型魚類研究会
• [Presentation] Different functional roles of hox clusters in zebrafish development (2019)
  • Author(s): Yamada K, Kikuchi M, Maeno A, Araki S, Akama K, Suzuki M, Ishizaka M, Kawamura A
  • Organizer: 第25回 小型魚類研究会
• [Presentation] ゼブラフィッシュ体幹部形成におけるhoxクラスターの機能解析 (2019)
  • Author(s): 山田一哉、荒木颯、前野哲輝、菊地守道、赤間燿、弥益恭、川村哲規
  • Organizer: 第71回日本動物学会関東支部会
• [Presentation] ゼブラフィッシュ肋骨形成における体節分節性の役割の解析 (2019)
  • Author(s): 乙坂栞里、江幡奏美、赤間燿、前野哲輝、田港朝仁、弥益恭、川村哲規
  • Organizer: 第71回日本動物学会関東支部会
• [Presentation] Autoregulatory loop of tbx6 enables the Ripply-dependent posterior shift of the expression domains of tbx6 transcription and Tbx6 protein in the zebrafish presomitic mesoderm (2018)
  • Author(s): Ban H, Yokota D, Otosaka S, Kinoshita H, Fujino F, Yabe T, Ovara H, Izuka A, Akama K, Kage D, Yamasu K, Takada S, and Kawamura A
  • Organizer: 第70回日本細胞生物学会・第51回日本発生生物学会合同大会
• [Book] 動物の辞典 (2021)
  • Author(s): 末光隆志 総編集 (分担執筆）
  • Total Pages: 772
  • Publisher: 朝倉書店
  • ISBN: 9784254171662
• [Remarks] 埼玉大学理学部生体制御学科ホームページ
  • URL: http://seitai.saitama-u.ac.jp/index.html
• [Remarks] 埼玉大学理学部生体制御学科・発生生物学研究室ホームページ
  • URL: http://devbiol.seitai.saitama-u.ac.jp/
• [Remarks] 埼玉大学理学部生体制御学科
  • URL: http://seitai.saitama-u.ac.jp/
• [Remarks] 埼玉大学理学部生体制御学科 発生生物学研究室
  • URL: http://devbiol.seitai.saitama-u.ac.jp/