ゼブラフィッシュを用いたHox遺伝子クラスターのゲノム機能解析

• Project/Area Number: 18K06177
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 43050:Genome biology-related
• Research Institution: Saitama University
• Principal Investigator: 川村 哲規 埼玉大学, 理工学研究科, 准教授 (10466691)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2020: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2019: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2018: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
• Keywords: Hox遺伝子群 / ゼブラフィッシュ / 発生遺伝学 / CRISPR-Cas9 / 機能進化 / 脊椎動物 / 多重変異体 / 遺伝子クラスター / 脊椎動物の前後軸 / Hoxクラスター / ゲノム構造

Outline of Annual Research Achievements

脊椎動物のHox遺伝子群の発見から四半世紀以上経った現在においても、その機能については不明な点が多く残されている。その大きな理由のひとつとして、脊椎動物の進化の初期で生じた2回の全ゲノム重複により、脊椎動物では4つ以上のHoxクラスターが存在し、それぞれが冗長性をもって機能していることが、ノックアウトマウスを用いた解析から示されている。真骨魚類ではHoxクラスターがさらに倍加し、ゼブラフィッシュでは7つのクラスター構造を有していることが知られる。本研究では、脊椎動物の形つくりの基本体制を備えた最も古い魚類に着目し、胚発生が早く、遺伝学的解析に優れたゼブラフィッシュの利点を生かし、それぞれのHox遺伝子クラスターをCRISPR-Cas9システムにより破壊した欠損体を作製し、脊椎動物におけるHox遺伝子クラスターの機能をマウスでの知見と比較し、hoxクラスターのゲノム機能進化を明らかにすることを目的とした。2019年度は、引き続き変異体の作製に取り組み、ゼブラフィッシュにある7つのhoxクラスター欠失した変異体を全て単離することに成功し、それぞれの変異体について詳細な表現形解析を行った。その結果、ゼブラフィッシュのhoxクラスターはマウスの対応するHoxクラスターと共通する機能が一部見られるものの、クラスター単位での機能が異なっていることが示唆された。以上のことから、Hoxクラスターは脊椎動物の初期に4つに倍加した後の進化の過程で、異なる機能分担化が生じたことが示唆された。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

2019年度末までに、ゼブラフィッシュの7つのhoxクラスター変異体の単離に成功し、それぞれの変異体について詳細な表現形解析がほぼ終了した。作製した変異体のうち5つのホモ変異体が成魚まで生存することが分かり、共同研究先と連携し、マイクロCT解析を導入し、生存したそれぞれの変異体の成魚の全身骨格および軟組織解析を行った。その結果、ゼブラフィッシュのhoxクラスターはマウスと一部共通する機能もみられるが、マウスとは異なる機能分担化が生じたことが示唆された。近々、これらの結果をまとめ、論文投稿をする予定である。また、単離した変異体について交配により変異を重ね、二重変異体、三重変異体を作製した。その結果、これまでにマウスHox変異体では報告されていない新規の興味深い表現形がいくつも見出されている。我々が見出した結果は、脊椎動物のHox遺伝子群の機能進化について、これまで考えられていたモデルとは異なる新たな概念を提示する可能性があると考えている。これらの結果は、申請時の想定を大きく超えるものであり、コロナウイルス対策の影響で研究が一時中断している状況であるが、本研究計画は当初の計画以上に進捗していると言える。

Strategy for Future Research Activity

まず、ゼブラフィッシュにある7つのhoxクラスター変異体の作製と表現形解析の結果をまとめ、論文として世に出すことを今年度の目標とする。それとともに、これまでの解析で見出された興味深い表現形について、クラスター内のどのhox遺伝子が必要であるのか、候補となるhox遺伝子にCRISPR-Cas9法により変異を導入し、表現形を再現するhox遺伝子群の組み合わせを同定する。

Research Products

• [Journal Article] Role of somite patterning in the formation of Weberian apparatus and pleural rib in zebrafish (2020)
  • Author(s): Akama, K., Ebata, K., Maeno, A., Taminato, T., Otosaka, S., Gengyo-Ando, K., Nakai, J., Yamasu, K., Kawamura, A.
  • Journal Title: Journal of Anatomy Volume: 236 Pages: 622-629
  • DOI: 10.1111/joa.13135
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Transcriptional autoregulation of zebrafish tbx6 is required for somite segmentation. (2019)
  • Author(s): Ban Hiroyuki、Yokota Daisuke、Otosaka Shiori、Kikuchi Morimichi、Kinoshita Hirofumi、Fujino Yuuri、Yabe Taijiro、Ovara Hiroki、Izuka Ayaka、Akama Kagari、Yamasu Kyo、Takada Shinji、Kawamura Akinori
  • Journal Title: Development Volume: 146 Pages: 1-11
  • DOI: 10.1242/dev.177063
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Functional roles of the Ripply-mediated suppression of segmentation gene expression at the anterior presomitic mesoderm in zebrafish. (2018)
  • Author(s): Kinoshita Hirofumi、Ohgane Nanae、Fujino Yuuri、Yabe Taijiro、Ovara Hiroki、Yokota Daisuke、Izuka Ayaka、Kage Daichi、Yamasu Kyo、Takada Shinji、Kawamura Akinori
  • Journal Title: Mechanisms of Development Volume: 152 Pages: 21-31
  • DOI: 10.1016/j.mod.2018.06.001
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Deadenylation by the CCR4-NOT complex contributes to the turnover of hairy-related mRNAs in the zebrafish segmentation clock (2018)
  • Author(s): Fujino Y, Yamada K, Sugaya C, Ooka Y, Ovara H, Ban H, Akama K, Otosaka S, Kinoshita H, Yamasu K, Mishima Y, Kawamura A.
  • Journal Title: FEBS Letters Volume: 592(20) Pages: 3388-3398
  • DOI: 10.1002/1873-3468.13261
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ゼブラフィッシュ胚発生におけるhoxクラスターの機能解析 (2020)
  • Author(s): 菊地守道、山田一哉、前野哲輝、荒木 颯、鈴木聖人、石坂瑞樹、赤間 燿、川村哲規
  • Organizer: 第72回 日本動物学会関東支部会
• [Presentation] 成長に伴うゼブラフィッシュの体節間血管の再配置に関する研究 (2020)
  • Author(s): 松野由美香、乙坂栞里、鈴木聖人、川村哲規
  • Organizer: 第72回 日本動物学会関東支部会
• [Presentation] ゼブラフィッシュ成魚の全身骨格および軟組織形成におけるhoxクラスターの機能解析 (2020)
  • Author(s): 鈴木聖人、山田一哉、前野哲輝、菊地守道、荒木 颯、石坂瑞樹、赤間 燿、川村 哲規
  • Organizer: 第72回 日本動物学会関東支部会
• [Presentation] Chemical Screeningを用いたゼブラフィッシュ肋骨形成の解析 (2020)
  • Author(s): 佐藤こうみ、川村哲規
  • Organizer: 第72回 日本動物学会関東支部会
• [Presentation] Transcriptional autoregulation oftbx6 is required for the somite segmentation in zebrafish embryos (2019)
  • Author(s): Ban H, Yokota D, Otosaka S, Kikuchi M, Kinoshita H, Fujino Y, Yabe T, Ovara H, Izuka A, Akama K, Yamasu K, Takada S, Kawamura A
  • Organizer: 第25回 小型魚類研究会
• [Presentation] Different functional roles of hox clusters in zebrafish development (2019)
  • Author(s): Yamada K, Kikuchi M, Maeno A, Araki S, Akama K, Suzuki M, Ishizaka M, Kawamura A
  • Organizer: 第25回 小型魚類研究会
• [Presentation] ゼブラフィッシュ体幹部形成におけるhoxクラスターの機能解析 (2019)
  • Author(s): 山田一哉、荒木颯、前野哲輝、菊地守道、赤間燿、弥益恭、川村哲規
  • Organizer: 第71回日本動物学会関東支部会
• [Presentation] ゼブラフィッシュ肋骨形成における体節分節性の役割の解析 (2019)
  • Author(s): 乙坂栞里、江幡奏美、赤間燿、前野哲輝、田港朝仁、弥益恭、川村哲規
  • Organizer: 第71回日本動物学会関東支部会
• [Presentation] Autoregulatory loop of tbx6 enables the Ripply-dependent posterior shift of the expression domains of tbx6 transcription and Tbx6 protein in the zebrafish presomitic mesoderm (2018)
  • Author(s): Ban H, Yokota D, Otosaka S, Kinoshita H, Fujino F, Yabe T, Ovara H, Izuka A, Akama K, Kage D, Yamasu K, Takada S, and Kawamura A
  • Organizer: 第70回日本細胞生物学会・第51回日本発生生物学会合同大会
• [Remarks] 埼玉大学理学部生体制御学科
  • URL: http://seitai.saitama-u.ac.jp/
• [Remarks] 埼玉大学理学部生体制御学科 発生生物学研究室
  • URL: http://devbiol.seitai.saitama-u.ac.jp/
• [Remarks] 埼玉大学理学部生体制御学科ホームページ
  • URL: http://seitai.saitama-u.ac.jp/index.html
• [Remarks] 埼玉大学理学部生体制御学科・発生生物学研究室ホームページ
  • URL: http://devbiol.seitai.saitama-u.ac.jp/