人工染色体へのFXS脆弱部位の搭載とCGGリピート不安定化再現モデルの作製

• Project/Area Number: 18K06183
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 43050:Genome biology-related
• Research Institution: Tottori University
• Principal Investigator: 中山 祐二 鳥取大学, 研究推進機構, 助教 (40432603)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2020: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000); Fiscal Year 2019: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2018: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
• Keywords: 脆弱X症候群 / 染色体工学 / 染色体脆弱部位 / 人工染色体

Outline of Annual Research Achievements

家族性の知的障害である脆弱X症候群（以下、FXS：Fragile X syndrome）はトリプレットリピート病であり、高い頻度で自閉症症状を併発することが多いため、その病態・病因の解明は、本疾患のみならず神経変性疾患の病態解明ならびに治療戦略の開発のためにも重要な位置付けにある。FXSの責任遺伝子であるFMR1(FMRP translational regulator 1)の5’非翻訳（UTR）領域に存在するCGGリピートは、正常、保因者、患者と長さが異なり、保因者の持つ100リピート程度を中心とした中程度のCGGリピートが母性伝播すると、一気に200リピート以上にまで伸長する。そのアレルを受け取った子孫（特に男児）では、FMR1プロモーターおよびCGGリピート周辺領域の高度のメチル化が誘導され、FMR1遺伝子の発現を抑制することで発症する。本疾患の分子メカニズムを解明するためには、FXS発症の根本的病因であるこれらの一連のクロマチン動態を再現し解析する系が必要であり、本研究では、その解決策として染色体工学を適用し、CGGリピート配列をコアとするFXS脆弱部位を機能的ヒト染色体領域として人工染色体上にクローニングし、FXS発症のエピジェネティックな分子基盤を明らかにするための真の細胞、そして動物モデルを構築することを目指している。
今年度は、初年度に引き続き、FXS脆弱部位を保持する人工染色体の構築のため、FXS保因者由来のヒトX染色体を保持するCHO細胞内において、FMR1遺伝子上流領域にCre/loxPシステムのためのloxP配列をCRISPR/Cas9系を用いて挿入する過程を進めてきた。現在、loxP配列が挿入されたクローンについて、人工染色体への搭載を進めている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

特にげっ歯類細胞内に存在するヒト染色体に対するCRISPR/Cas9系を用いた染色体改変の効率は高くなく、loxP配列の挿入に時間がかかったため。初年度に達成できなかったポイントはクリアできたが、人工染色体への搭載という当初計画からは遅れている。

Strategy for Future Research Activity

今後の研究も引き続き、本研究の核となるべきFXS脆弱部位の構築を第一優先に進める。現在の進捗状況を鑑みると、本科研費内では、FXS脆弱部位を搭載した人工染色体を完成させ、in vitroモデルを構築するところを一つの目標とする。さらに、FXSに関連したCGGリピート制御に関わる因子やパスウェイを絞っていき、モデル系が完成した際に解析・操作すべき因子の候補を見出しておくためにも、ヒト細胞（セルバンクより入手）を用いた網羅的な解析を進めていく。

Research Products

• [Journal Article] Increased PD-1-positive macrophages in the tissue of gastric cancer are closely associated with poor prognosis in gastric cancer patients (2020)
  • Author(s): Kono, Y. Saito, H. Miyauchi, W. Shimizu, S. Murakami, Y. Shishido, Y. Miyatani, K. Matsunaga, T. Fukumoto, Y. Nakayama, Y. Sakurai, C. Hatsuzawa, K. Fujiwara, Y.
  • Journal Title: BMC Cancer Volume: 20 Pages: 175-183
  • DOI: 10.1186/s12885-020-6629-6
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A novel Xist RNA-mediated chromosome inactivation model using a mouse artificial chromosome. (2020)
  • Author(s): Inaoka, D. Sunamura, N. Ohira, T. Nakayama, Y. Kugoh, H.
  • Journal Title: Biotechnology Letters Volume: 42 Pages: 697-705
  • DOI: 10.1007/s10529-020-02826-z
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Subclinical Epstein-Barr Virus Primary Infection and Lytic Reactivation Induce Thyrotropin Receptor Autoantibodies (2019)
  • Author(s): Tamoto N, Nagata K, Hara S, Nakayama Y, Kuwamoto S, Matsushita M, Kato M, Hayashi K
  • Journal Title: Viral Immunology Volume: 32 Pages: 362-369
  • DOI: 10.1089/vim.2019.0086
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Increased regulatory B cells are involved in immune evasion in patients with gastric cancer (2019)
  • Author(s): Murakami, Y. Saito, H. Shimizu, S. Kono, Y. Shishido, Y. Miyatani, K. Matsunaga, T. Fukumoto, Y. Ashida, K. Sakabe, T. Nakayama, Y. Fujiwara, Y.
  • Journal Title: Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ Volume: 9 Pages: 13083-13083
  • DOI: 10.1038/s41598-019-49581-4
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] High Level Estradiol Induces EBV Reactivation and EBV gp350/220(+)CD138(+) Double-positive B Cell Population in Graves’ Disease Patients and Healthy Controls (2019)
  • Author(s): Hara S, Nagata K, Nakayama Y, Higaki K, Matsushita M, Kuwamoto S, Kato M, Hayashi K
  • Journal Title: Yonago Acta Med. Volume: 62 Issue: 2 Pages: 240-243
  • DOI: 10.33160/yam.2019.06.010
  • NAID: 130007665218
  • ISSN: 0513-5710, 1346-8049
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Epstein-Barr Virus Lytic Reactivation Induces IgG4 Production by Host B Lymphocytes in Graves' Disease Patients and Controls: A Subset of Graves' Disease Is an IgG4-Related Disease-Like Condition. (2018)
  • Author(s): Nagata K, Hara S, Nakayama Y, Higaki K, Sugihara H, Kuwamoto S, Matsushita M, Kato M, Tanio S, Ishiguro K, Hayashi K.
  • Journal Title: Viral Immunol Volume: 31 (8) Pages: 540-547
  • DOI: 10.1089/vim.2018.0042
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Anticancer effects of hyper-coordinated germanium complex in human lung cancer cells (2019)
  • Author(s): Kashiwagi A, Nakayama Y, Ishiguro N, Nanjo M
  • Organizer: ICCOC-GTL-16
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Involvement of RAN translation product, FMRpolyG and neurodegeneration in Fragile X-associated Tremor/Ataxia Syndrome (FXTAS) (2019)
  • Author(s): Involvement of RAN translation product, FMRpolyG and neurodegeneration in Fragile X-associated Tremor/Ataxia Syndrome (FXTAS) : Susumu Ikenoshita1, Yuji Nakayama, Kaori Adachi, Hiroyuki Kugoh, Kazuhiro Ishii, Tohru Matsuura, Eiji Nanba, Norifumi Shioda
  • Organizer: 19th International Workshop on Fragile X and other Neurodevelopmental Disorders, Sorrento, Italy,
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] G-quadruplex-binding metabolites rescue decreased cognitive deficits seen in FXTAS model mice (2019)
  • Author(s): Sefan Asamitsu1, Yasushi Yabuki, Yuji Nakayama, Kaori Adachi, Hiroyuki Kugoh, Hiroshi Sugiyama, Eiji Nanba, Kohji Fukuanga, Norifumi Shioda
  • Organizer: 19th International Workshop on Fragile X and other Neurodevelopmental Disorders, Sorrento, Italy,
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 30.Development of a novel screening system for the carcinogens in the tobacco smoke using mouse artificial chromosome (2019)
  • Author(s): Kashiwagi A, Nakayama Y, Kugoh H
  • Organizer: The 6 th Asian conference on safety and education in laboratory (Bali)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Current Status of Fragile X study in Japan (2018)
  • Author(s): Yuji Nakayama, Kaori Adachi, Norifumi Shioda, Hiroyuki Kugoh and Eiji Nanba
  • Organizer: 16th International Fragile X conference
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 染色体操作により樹立した脆弱X症候群および関連疾患モデル細胞の解析 (2018)
  • Author(s): 中山祐二、足立香織、塩田倫史、久郷裕之、難波栄二
  • Organizer: 日本人類遺伝学会 第６３回大会
• [Presentation] 脆弱X関連振戦／失調症候群（FXTAS）におけるRAN蛋白質の病態との関与 (2018)
  • Author(s): 塩田倫史、中山祐二、足立香織、久郷裕之、難波栄二
  • Organizer: 日本人類遺伝学会 第６３回大会
• [Presentation] X染色体不活性化機構の解明に向けた人工染色体の活用 (2018)
  • Author(s): 稲岡大悟、大平崇人、押村光雄、中山祐二、久郷裕之
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会