人工染色体へのFXS脆弱部位の搭載とCGGリピート不安定化再現モデルの作製

• Project/Area Number: 18K06183
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 43050:Genome biology-related
• Research Institution: Tottori University
• Principal Investigator: 中山 祐二 鳥取大学, 研究推進機構, 助教 (40432603)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2020: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000); Fiscal Year 2019: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2018: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
• Keywords: 脆弱X症候群 / ゲノム編集 / 染色体脆弱部位 / 人工染色体 / 染色体工学

Outline of Annual Research Achievements

家族性の知的障害である脆弱X症候群（以下、FXS：Fragile X syndrome）はトリプレットリピート病に分類される。罹患者は自閉症症状を併発することが多いため、難治性疾患であるFXSの病態・病因の解明は、神経変性疾患の機能解明ならびに治療の開発のためにも重要な位置付けにある。FXSの責任遺伝子であるFMR1(FMPR Translational Regulator 1)の5’非翻訳（UTR）領域に存在するCGGリピートは、正常、保因者、患者と長さが異なり、特に保因者の持つ100リピート程度を中心とした中程度のCGGリピートが母性伝播すると一気に200リピート以上にまで伸長し、FMR1プロモーターおよびCGGリピート周辺領域の高度のメチル化の後、FMR1遺伝子の発現を抑制する。これらのゲノム、あるいはエピゲノム変化を再現するためには、単にリピート領域だけでなく、それを制御するためには周辺の広いゲノム領域が関与していることが示唆されている。
本研究ではFXS発症の根本的病因であるこれらの一連のクロマチン動態を再現し解析するために、CGGリピート配列をコアとするFXS脆弱部位を機能的ヒト染色体領域として人工染色体上にクローニングし真のFXS細胞モデルを構築することを目指している。前年度に引き続き、FXS保因者由来のヒトX染色体を保持するCHO細胞内において、FXS脆弱部位を保持する人工染色体の構築のために必要なヒトX染色体の改変を続け、今年度は全ての過程を完了することができた。人工染色体への脆弱部位の搭載のステップに進むことができる資材が得られた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

初年度から今に至るまでゲノム編集技術であるCRISPR/Cas9系を用いてヒトX染色体の改変を進めてきて、ヒトX染色体の必要な改変が全て終了したことは一区切りとして良い成果となった。しかし、人工染色体の構築までを目的とした本研究の計画からは遅れたままとなった。FMR1上流領域はgene poorであり配列がリピート様の領域がほとんどである。そのため、挿入するloxP配列や人工テロメアを持つターゲットベクターを構築することに時間を要した。さらにそれらのゲノムへの挿入および編集の効率が予想以上に低頻度であった。これらの要因から、ゲノム編集技術によるX染色体の改変には想定以上に時間がかかってしまった。

Strategy for Future Research Activity

本研究では、FMR1遺伝子座に加えて、その上流領域と下流領域、全て合わせて約200kbの脆弱部位を人工染色体にクローニングする準備ができた。本研究はFXS脆弱部位を保持する人工染色体の構築を成功させなければ先に進むことができないので、引き続き、本資材を用いて、人工染色体の構築を進めていく。一方、2018年の報告で、「FMR1のCGGリピート動態を制御する染色体領域がもっと広い」という可能性が示された。これを受けて、本研究で得られた資材とは別に、脆弱部位としてクローニングする予定の領域を大きく（長く）したバージョンの作成も着手しているところである。

Research Products

• [Journal Article] Establishment of FXS-A9 panel with a single human X chromosome from fragile X syndrome-associated individual (2021)
  • Author(s): Nakayama Yuji、Adachi Kaori、Shioda Nofirifumi、Maeta Shoya、Nanba Eiji、Kugoh Hiroyuki
  • Journal Title: Experimental Cell Research Volume: 398 Pages: 112419-112419
  • DOI: 10.1016/j.yexcr.2020.112419
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] CGG repeat RNA G-quadruplexes interact with FMRpolyG to cause neuronal dysfunction in fragile X-related tremor/ataxia syndrome (2021)
  • Author(s): Asamitsu Sefan、Yabuki Yasushi、Ikenoshita Susumu、Kawakubo Kosuke、Kawasaki Moe、Usuki Shingo、Nakayama Yuji、Adachi Kaori、Kugoh Hiroyuki、Ishii Kazuhiro、Matsuura Tohru、Nanba Eiji、Sugiyama Hiroshi、Fukunaga Kohji、Shioda Norifumi
  • Journal Title: Science Advances Volume: 7
  • DOI: 10.1126/sciadv.abd9440
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Establishment of human immortalized mesenchymal stem cells lines for the monitoring and analysis of osteogenic differentiation in living cells (2020)
  • Author(s): Narai Takashi、Watase Ryohei、Nakayama Yuji、Kodani Isamu、Inoue Toshiaki、Kokura Kenji
  • Journal Title: Heliyon Volume: 6
  • DOI: 10.1016/j.heliyon.2020.e05398
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Increased PD-1-positive macrophages in the tissue of gastric cancer are closely associated with poor prognosis in gastric cancer patients (2020)
  • Author(s): Kono, Y. Saito, H. Miyauchi, W. Shimizu, S. Murakami, Y. Shishido, Y. Miyatani, K. Matsunaga, T. Fukumoto, Y. Nakayama, Y. Sakurai, C. Hatsuzawa, K. Fujiwara, Y.
  • Journal Title: BMC Cancer Volume: 20 Pages: 175-183
  • DOI: 10.1186/s12885-020-6629-6
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A novel Xist RNA-mediated chromosome inactivation model using a mouse artificial chromosome (2020)
  • Author(s): Inaoka, D. Sunamura, N. Ohira, T. Nakayama, Y. Kugoh, H.
  • Journal Title: Biotechnology Letters Volume: 42 Pages: 697-705
  • DOI: 10.1007/s10529-020-02826-z
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Subclinical Epstein-Barr virus primary infection and lytic reactivation induce thyrotropin receptor autoantibodies (2019)
  • Author(s): Tamoto N, Nagata K, Hara S, Nakayama Y, Kuwamoto S, Matsushita M, Kato M, Hayashi K
  • Journal Title: Viral Immunology Volume: 32 Pages: 362-369
  • DOI: 10.1089/vim.2019.0086
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Increased regulatory B cells are involved in immune evasion in patients with gastric cancer (2019)
  • Author(s): Murakami, Y. Saito, H. Shimizu, S. Kono, Y. Shishido, Y. Miyatani, K. Matsunaga, T. Fukumoto, Y. Ashida, K. Sakabe, T. Nakayama, Y. Fujiwara, Y.
  • Journal Title: Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ Volume: 9 Pages: 13083-13083
  • DOI: 10.1038/s41598-019-49581-4
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] High Level Estradiol Induces EBV Reactivation and EBV gp350/220(+)CD138(+) Double-positive B Cell Population in Graves’ Disease Patients and Healthy Controls (2019)
  • Author(s): Hara S, Nagata K, Nakayama Y, Higaki K, Matsushita M, Kuwamoto S, Kato M, Hayashi K
  • Journal Title: Yonago Acta Med. Volume: 62 Issue: 2 Pages: 240-243
  • DOI: 10.33160/yam.2019.06.010
  • NAID: 130007665218
  • ISSN: 0513-5710, 1346-8049
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Epstein-Barr Virus Lytic Reactivation Induces IgG4 Production by Host B Lymphocytes in Graves' Disease Patients and Controls: A Subset of Graves' Disease Is an IgG4-Related Disease-Like Condition. (2018)
  • Author(s): Nagata K, Hara S, Nakayama Y, Higaki K, Sugihara H, Kuwamoto S, Matsushita M, Kato M, Tanio S, Ishiguro K, Hayashi K.
  • Journal Title: Viral Immunol Volume: 31 (8) Pages: 540-547
  • DOI: 10.1089/vim.2018.0042
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Anticancer effects of hyper-coordinated germanium complex in human lung cancer cells (2019)
  • Author(s): Kashiwagi A, Nakayama Y, Ishiguro N, Nanjo M
  • Organizer: ICCOC-GTL-16
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Involvement of RAN translation product, FMRpolyG and neurodegeneration in Fragile X-associated Tremor/Ataxia Syndrome (FXTAS) (2019)
  • Author(s): Involvement of RAN translation product, FMRpolyG and neurodegeneration in Fragile X-associated Tremor/Ataxia Syndrome (FXTAS) : Susumu Ikenoshita1, Yuji Nakayama, Kaori Adachi, Hiroyuki Kugoh, Kazuhiro Ishii, Tohru Matsuura, Eiji Nanba, Norifumi Shioda
  • Organizer: 19th International Workshop on Fragile X and other Neurodevelopmental Disorders, Sorrento, Italy,
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] G-quadruplex-binding metabolites rescue decreased cognitive deficits seen in FXTAS model mice (2019)
  • Author(s): Sefan Asamitsu1, Yasushi Yabuki, Yuji Nakayama, Kaori Adachi, Hiroyuki Kugoh, Hiroshi Sugiyama, Eiji Nanba, Kohji Fukuanga, Norifumi Shioda
  • Organizer: 19th International Workshop on Fragile X and other Neurodevelopmental Disorders, Sorrento, Italy,
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 30.Development of a novel screening system for the carcinogens in the tobacco smoke using mouse artificial chromosome (2019)
  • Author(s): Kashiwagi A, Nakayama Y, Kugoh H
  • Organizer: The 6 th Asian conference on safety and education in laboratory (Bali)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Current Status of Fragile X study in Japan (2018)
  • Author(s): Yuji Nakayama, Kaori Adachi, Norifumi Shioda, Hiroyuki Kugoh and Eiji Nanba
  • Organizer: 16th International Fragile X conference
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 染色体操作により樹立した脆弱X症候群および関連疾患モデル細胞の解析 (2018)
  • Author(s): 中山祐二、足立香織、塩田倫史、久郷裕之、難波栄二
  • Organizer: 日本人類遺伝学会 第６３回大会
• [Presentation] 脆弱X関連振戦／失調症候群（FXTAS）におけるRAN蛋白質の病態との関与 (2018)
  • Author(s): 塩田倫史、中山祐二、足立香織、久郷裕之、難波栄二
  • Organizer: 日本人類遺伝学会 第６３回大会
• [Presentation] X染色体不活性化機構の解明に向けた人工染色体の活用 (2018)
  • Author(s): 稲岡大悟、大平崇人、押村光雄、中山祐二、久郷裕之
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会