Effects of RNA modification and local translation in the growth cone on neural circuit formation

Research Project

Project/Area Number	18K06464
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 46010:Neuroscience-general-related
Research Institution	The University of Tokushima
Principal Investigator	梅嶋宏樹徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 助教 (40525375)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000) Fiscal Year 2020: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2019: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2018: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Keywords	神経発生 / 神経細胞 / 突起伸長 / RNA / 成長円錐 / 局所翻訳
Outline of Annual Research Achievements	神経突起が伸長する際には突起の先端に成長円錐と呼ばれる手の平状の構造が形成される。成長円錐には様々なガイダンス分子受容体や細胞接着分子が発現しており、アクチン骨格に依存して活発に動きながら周囲の環境を探索し神経突起を適切な接続先へと誘導する。成長円錐には多数のメッセンジャーRNA（mRNA）が局在することが知られており、細胞体とは独立したタンパク質翻訳機構により成長円錐に特異的な遺伝子発現を行なうことで成長円錐の機能を実現している。成長円錐における局所翻訳機構が神経突起の伸長やガイダンスに関与することはよく知られているが、局所翻訳が成長円錐においてどのようにして制御されているのかについてはいまだ不明な点が多い。本研究では成長円錐の機能を制御する局所翻訳メカニズムを明らかにすることを目指しmRNAの化学修飾に注目している。mRNAのアデノシンN6メチル化修飾（m6A修飾）はmRNAの特定のアデノシンに可逆的にメチル基を付加することによってmRNAの翻訳効率や分解速度を制御することが知られている。本研究ではm6A修飾関連遺伝子の発現を分散培養下のニューロンにおいてRNAiノックダウン法を用いて撹乱し神経突起伸長への影響を検討する。さらに生体における神経回路形成へのm6A修飾関連遺伝子の役割を検証するために、子宮内電気穿孔法を用いて胎児期マウス大脳皮質においてm6A修飾関連分子をノックダウンし神経回路の形成過程への影響を調べる。また並行して、RNA顆粒や翻訳の制御に関与する報告があるHSP90にも着目している。免疫染色法によりHSP90のアイソフォーム特異的な細胞局在を調べたところ、βアイソフォームが神経突起の先端まで局在しており成長円錐において作用する可能性が考えられた。上記の結果については第128回日本解剖学会・全国学術集会において発表した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason マウス海馬ニューロン分散培養系において、m6A修飾関連分子をRNAiノックダウンベクターを用いて発現抑制し神経細胞の軸索や樹状突起の形成・伸長に及ぼす影響を検討した。m6A修飾関連遺伝子としてはWriterであるMettl14、EraserであるFto、ReaderであるYthdf1~3などを対象とした。RNAiのノックダウン効率は免疫染色法により確認した。いくつかの遺伝子についてノックダウンにより軸索や樹状突起の伸長および細胞形態の変化などが確認できた。また、生体内における神経回路形成への影響を調べるために、マウス胎児脳に子宮内電気穿孔法を用いて上記のm6A修飾関連遺伝子に対するノックダウンベクターを導入し軸索伸長や樹状突起形成、細胞形態への影響を検討することを行なっている。子宮内電気穿孔法による遺伝子導入系の立ち上げは完了しており、いくつかのノックダウンベクターについて効果を検討したところ、神経突起の形成および伸長についての影響を示唆する結果が見られている。また、神経細胞の局所翻訳に関与する候補分子としてm6A修飾関連遺伝子と並行してHSP90にも着目している。HSP90は生理条件下においてRNA顆粒や翻訳の制御に関与することが報告されており、成長円錐での局所翻訳にも関わる可能性が考えられる。免疫染色法によりHSP90のアイソフォーム特異的な細胞内局在を調べたところ、αアイソフォームが細胞体に局在するのに対してβアイソフォームはより神経突起の先端まで分布しておりβアイソフォームが成長円錐において作用する可能性が考えられる。本研究については、初年度に研究代表者の異動に伴って研究環境を新たに立ち上げ直す必要が生じたこと、新型コロナウイルス感染対策への対応に伴う業務に関連して研究の進捗がやや遅れている。次年度は引き続き今年度予定していた実験を進める。
Strategy for Future Research Activity	これまでに系を確立し現在実験を進めている海馬ニューロン分散培養系および子宮内電気穿孔法を用いた胎児期マウス大脳皮質へのノックダウンベクター遺伝子導入による神経細胞の形態変化の検討を引き続き進める。また、細胞形態の変化についてより詳細に調べるためにノックダウンした神経細胞におけるアクチン骨格や微小管骨格の構造を免疫細胞染色などを用いて調べる。さらに、m6A修飾分子が成長円錐における局所翻訳に影響するかを検討するため、局所翻訳を介して神経突起の伸長やガイダンスを促進することが知られている神経成長因子を投与した際の応答が上記遺伝子をノックダウンすることで変化するかを調べる。並行してHSP90の各アイソフォームをノックダウンし神経細胞における細胞の形態変化およびRNA顆粒の制御と局所翻訳機構に影響を及ぼすかを検討する。