超高感度酵素アッセイシステムの構築を目指した新規脂質ナノ粒子発光デバイスの開発
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18K06612
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 47020:Pharmaceutical analytical chemistry and physicochemistry-related
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| Research Institution | Kyoto Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
武上 茂彦 京都薬科大学, 薬学部, 准教授 (70298686)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2019)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2018: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | 脂質ナノ粒子 / イクオリン / グルタチオン / γ-グルタミルトランスフェラーゼ / 生物発光 / 発光デバイス / 酵素アッセイ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本申請課題は、革新的な酵素アッセイシステムを構築するために、粒子の表面を酵素－基質の特異的反応の場として提供し、感度と特異性に優れた新規な脂質ナノ粒子発光デバイス（LNPLD）を開発することを目的としている。初年度（平成30年度）は、グルタチオン（GSH）をモデル基質として選び、γ-グルタミルトランスフェラーゼ（γ-GT）アッセイを可能とするLNPLDの粒子設計をおこなった。今年度（令和1年度）は、前年度に設計したGSHを粒子表面に修飾したLNPLD（GSH-LNPLD）を用い、γ-GT量が定量できるかを検討した。GSH-LNPLD懸濁液はUV照射後に白色から青色へと視覚的に変化した。このことから、GSHをLNPLD表面に修飾してもGSHは脂質間の重合を妨害することなく、GSH-LNPLDを調製できることが示された。GSH-LNPLDでは、γ-GT溶液を添加するとGSH-LNPLD中に封入しているイクオリン（AQ）の発光が観測された。これは、粒子表面のGSHにγ-GTが反応し、その結果としてAQが発光したと考えられた。加えて、γ-GTの濃度依存性も観測され、0.1～0.4 Uのγ-GT量の範囲においてAQの発光強度との間で直線性が認められた。一方、GSHを修飾していないLNPLDではγ-GTを添加してもAQの発光はほとんど観測されず、かつγ-GT量が増加してもAQの発光強度は増加しなかった。これらの結果から、GSHはLNPLDの表面に修飾されていること、およびGSH-LNPLDはγ-GTの検出に適用できる可能性を有することが示された。今後は、GSH-LNPLDの安定性とγ-GTに対する応答性の向上を目指し研究を進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
脂質ナノ粒子発光デバイス（LNPLD）中に封入しているイクオリンの安定性を保持しつつ、グルタチオン（GSH）をLNPLDの脂質膜表面に修飾することに時間を要した。緩衝液中にカルシウムイオンが存在するとイクオリンと反応するため、当初、緩衝液中にEDTAを含有させ、カルシウムによるイクオリンの失活を防ぐことを試みた。しかし、EDTA含有緩衝液中では、γ-グルタミルトランスフェラーゼ（γ-GT）のLNPLDに対する応答性が低かったため、EDTA含有緩衝液の使用を取りやめた。現在は、ウシ血清アルブミンとイクオリンを混合することにより、イクオリンの安定性が若干改善されたため、この調製法でLNPLDを作製し、データを取得中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在のグルタチオン修飾脂質ナノ粒子発光デバイス（GSH-LNPLD）では、γ-グルタミルトランスフェラーゼ（γ-GT）の定量域は、0.1～0.4 Uであり、臨床現場において使用するには感度が不足している。これは、GSHがLNPLDに仮定している量よりもかなり少ない量しか修飾できていない可能性が考えられる。したがって、今後は、感度をより向上させるべく、GSHの効果的なLNPLDへの修飾方法の検討、およびGSHがLNPLDに修飾されているかについて、ゼータ電位計等を用いて評価していく予定である。
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Report
(2 results)
Research Products
(5 results)
