Effects of multiple binding sites of CYP2C9 on its allosteric modulation
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18K06613
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 47020:Pharmaceutical analytical chemistry and physicochemistry-related
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| Research Institution | Doshisha Women's College of Liberal Arts |
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Principal Investigator |
前川 京子 同志社女子大学, 薬学部, 教授 (70270626)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安達 基泰 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 量子生命科学領域, 上席研究員(定常) (60293958)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2021)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2018: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | 薬物代謝酵素 / 遺伝子多型 / X線結晶構造解析 / CYP2C9 / 構造活性相関 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
薬物代謝酵素CYP2C9は、複数の基質結合部位を有するアロステリック酵素である。Ｘ線結晶構造解析により、CYP2C9.1（野生型）とCYP2C9.2（*2変異型）では、ロサルタンの結合部位と結合数が異なることを明らかにしている。また活性測定の結果から、CYP2C9.2のロサルタンに対する結合の親和性は、CYP2C9.1と同等であること、一方で、最大反応速度はCYP2C9.1の約50％に低下することを見出している。
今年度は、等温滴定カロリメトリー(ITC)法を用いた相互作用解析を継続した。CYP2C9.1とロサルタンとの相互作用はエンタルピー依存的な発熱反応であり、強固な水素結合のネットワーク形成に構造変化を伴う相互作用の可能性が示唆された。さらに、CYP2C9.1とCYP2C9.2のロサルタンに対するKd値はほぼ同等であり、結合部位数Nは両者で変化しなかった。ITCによる結果は、野生型にはロサルタンの結合部位が3箇所あるとするX線結晶構造解析の結果とは矛盾するものの、活性測定の結果とは一致しており、CYP2C9.2による活性低下は、ロサルタンが活性中心に結合して以降の段階に起因すると考えた。そこで、Cytochome P450 Reductase（CPR）による電子伝達効率の低下が、CYP2C9.2による活性低下に影響を及ぼしているのではないかと考え、CPRの大腸菌での発現、精製を開始した。CPR組換えタンパク質発現用のプラスミドを3種の大腸菌にトランスフォーメーションし、Cytochrome C還元活性を指標に発現量を比較し、発現に用いる大腸菌の種類や培養条件等を検討した。また、NiアフィニティークロマトグラフィーによりCPRの一次精製が可能であることが明らかにした。今後はさらにCPR精製条件の検討を進め、精製CPRとCYP2C9の相互作用を解析する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
新型コロナウイルス感染症の拡大で、海外からの代謝物標準品やたんぱく質精製カラムの納品に遅延が生じた。
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| Strategy for Future Research Activity |
納期に遅れが生じている消耗品に関しては、納品され次第、実験を開始できるように準備を進める。
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Report
(4 results)
Research Products
(10 results)
