細胞膜内層のスフィンゴミエリンの解析-フリッパーゼの同定と生理的意義の解明-
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18K06677
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 47030:Pharmaceutical hygiene and biochemistry-related
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
阿部 充宏 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (90415068)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2019)
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| Budget Amount *help |
¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2018: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
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| Keywords | スフィンゴミエリン / フリップフロップ / 脂質ラフト / 細胞膜 / CRISPR/Cas9 / ノックダウン / 脂質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度までに、スフィンゴミエリン（以下，SM）が細胞膜外層から細胞膜内層にフリップするために必要な因子として、10個程度の遺伝子を同定した。本年度は、このうち最も強い表現型を示した1つの因子について解析を行った。まず、リコンビナントタンパク質を作製し、人工膜を用いたin vitroの系での解析を行った。細胞膜に局在する脂質との結合能を調べた結果、リコンビナントタンパク質はPIP2に特異的に結合することが明らかになった。人工膜の形状を電子顕微鏡で調べた結果、リコンビナントタンパク質はPIP2依存的に人工膜のtubule化を引き起こすことがわかった。蛍光ラベルしたスフィンゴミエリンを人工膜中に取り込ませ、リコンビナントタンパク質を加えると、PIP2依存的にスフィンゴミエリンのフリップが促進されることがわかった。このこれらの結果を考え合わせると、本研究で同定されたタンパク質は、PIP2と結合し、膜を変形させ、SMのフリップを促進していることが示唆された。
次にin vivoでの機能を調べるために、細胞における表現型を調べた。CRISPR/Cas9によるノックアウト株と過剰発現株を用いた。フリーズフラクチャーによる電子顕微鏡観察においてSMの分布を調べた結果、ノックアウト株では異常は認められなかったが、過剰発現株では細胞膜外層のSMが少なくなっていることがわかった。また、過剰発現株では、細胞膜内層においてtubule化したと考えられる痕跡が観察された。これらの電子顕微鏡の観察結果は、前述のin vitroの実験結果を裏付けるものであり、実際の細胞中でも膜を変形させ、SMのフリップを促進していることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
最も強い表現型を示した1つの因子のリコンビナントタンパク質が、in vitroでスフィンゴミエリンのフリップを促進する活性を有することがわかった。また、in vivoでも同様な活性を有することが示唆された。フリーズフラクチャー電子顕微鏡解析は、連携研究員の村手研究員がフランスで系を立ち上げたが、研究機関の立ち入り禁止のため、途中で止まっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回得られた因子はシャルコー・マリー・トゥース病の原因遺伝子である。次年度は生化学的な実験を行い、シャルコー・マリー・トゥース病の変異の機能解析を行う。変異型リコンビナントタンパク質を作成し、PIP2との結合能、人工膜の形状・フリップの活性を測定する。また、フランスの状況次第ではあるが、フリーズフラクチャー電子顕微鏡解析を行うことにより、変異型タンパク質を発現した細胞における表現型を調べる。
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Report
(2 results)
Research Products
(4 results)
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[Journal Article] Resolvin E3 Attenuates Allergic Airway Inflammation via the interleukin-23-interleukin-17A Pathway2019
Author(s)
Sato M, Aoki-Saito H, Fukuda H, Ikeda H, Koga Y, Yatomi M, Tsurumaki H, Maeno T, Saito T, Nakakura T, Mori T, Yanagawa M, Abe M, Sako Y, Dobashi K, Ishizuka T, Yamada M, Shuto S, Hisada T.
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Journal Title
FASEB J
Volume: Nov;33(11)
Pages: 12750-12759
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access
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