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スコパリアが産生する四環性ジテルペン骨格のダイバーシティを制御する分子機構の解明

Research Project

Project/Area Number 18K06729
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Allocation TypeMulti-year Fund
Section一般
Review Section Basic Section 47050:Environmental and natural pharmaceutical resources-related
Research InstitutionUniversity of Toyama

Principal Investigator

山村 良美  富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 助教 (30464027)

Project Period (FY) 2018-04-01 – 2022-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2020)
Budget Amount *help
¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2018: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Keywordsジテルペン / 環化酵素 / 有用物質生産 / P450 / RNA-Seq / 植物二次代謝 / チトクロームP450 / エリシター / 二次代謝
Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は「スコパリア植物の二次代謝産物の生合成酵素を包括的に解析することによって、四環性ジテルペンの骨格形成のダイバーシティを制御する分子機構を解明すること」である。この目的のために、R2年度はSDB生合成機構におけるSdKSL1酵素反応の次のステップであるscopadula-13-α-olの水酸化反応に関与すると推定されるP450候補遺伝子の単離を試みた。まず、我々の先行研究により得られたトランスクリプトーム解析の結果から標的としている水酸化反応に関与していると予測されるP450(CYP71 またはCYP76 ファミリーである可能性が高い)の候補を26個ピックアップした。これらの候補遺伝子からプライマーを設計し、定量的リアルタイムPCR 法で遺伝子発現の器官特異性をを解析した。その結果、5つの候補を絞ることができ、これらの遺伝子の全長cDNAクローンを単離した。
今回得られた情報は、植物が産生するラブダン関連ジテルペンの骨格多様性のメカニズムの解明に大きく寄与すると考えられる。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本年度は生合成に関与するP450候補遺伝子の探索を行った。
まず、我々の先行研究により得られたトランスクリプトーム解析の結果から標的としている水酸化反応に関与していると予測されるP450(CYP71 またはCYP76 ファミリーである可能性が高い)の候補を26個ピックアップした。これらの候補遺伝子の配列からプライマーを設計し、定量的リアルタイムPCR 法で各遺伝子発現の器官特異性を解析した。その結果、SDBの蓄積器官である若葉に強く発現していた7つのP450候補遺伝子を絞ることができた。次に、これらの遺伝子の全長cDNAクローンを単離した。取得したcDNAにはP450に特有の3つのモチーフおり、N末端のシグナルペプチドも特定できた。

Strategy for Future Research Activity

先行研究により得られたP450候補遺伝子のメチルジャスモン酸刺激、サリチル酸処理等をした細胞を用いて、定量的リアルタイムPCR法で遺伝子発現の変動を解析する。その解析の結果からSDB生合成と相関性のあるものに焦点をあて、酵素の機能解析を進める。GGPP の上流の遺伝子(具体的にはメバロン酸生合成経路上の酵素遺伝子群)を既存の大腸菌in vivo システムに共導入することで、生産システムの効率的な効果が得られるかを検証する。この改良型のscopadula-13-α-ol 生産株に作製したP450/CPR 発現ベクターを導入し、発現を誘導した大腸菌から酵素反応生成物についてGC-MS で分析する。生成物については、必要に応じてNMR 解析を行う。P450 の機能が同定できた場合、P450 の活性に重要な補因子である電子伝達系タンパク質に加えてNADPH 再生酵素を共導入し、その効果も検討する。また、遺伝子ファミリーにおけるアミノ酸配列の違いが、P450 分子種の基質認識に及ぼす影響も検討した上で、ジテルペン生合成に関与するホモログを特定する。

Report

(3 results)
  • 2020 Research-status Report
  • 2019 Research-status Report
  • 2018 Research-status Report

Research Products

(7 results)

All 2020 2019

All Journal Article (2 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 1 results,  Open Access: 1 results) Presentation (5 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results)

  • [Journal Article] Divergent Evolution of the Diterpene Biosynthesis Pathway in Tea Plants (Camellia sinensis) Caused by Single Amino Acid Variation of ent-Kaurene Synthase2020

    • Author(s)
      Yang Mei、Liu Guanhua、Yamamura Yoshimi、Chen Feng、Fu Jianyu
    • Journal Title

      Journal of Agricultural and Food Chemistry

      Volume: 68 Pages: 9930-9939

    • DOI

      10.1021/acs.jafc.0c03488

    • Related Report
      2020 Research-status Report
  • [Journal Article] Functional characterization of NADPH-cytochrome P450 reductase and cinnamic acid 4-hydroxylase encoding genes from Scoparia dulcis L.2020

    • Author(s)
      Yamamura Yoshimi、Mabuchi Ayaka
    • Journal Title

      Botanical Studies

      Volume: 61 Pages: 6-6

    • DOI

      10.1186/s40529-020-00284-4

    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Presentation] Identification of key genes involved in scopadulane-type diterpene biosynthesis in Scoparia dulcis2020

    • Author(s)
      Yamamura Y and Lee JB
    • Organizer
      Plant Biology 2020 World Wide Summit
    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Isolation and functional characterization of UDP-glucosyltransferases involved in the benzoxazinoid biosynthesis in Scoparia dulcis2020

    • Author(s)
      Kasai Y, Lee JB, Yamamura Y
    • Organizer
      Plant Biology 2020 World Wide Summit
    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] In vivo functional characterization of eight new terpene synthase genes from medicinal plant Scoparia dulcis2020

    • Author(s)
      Yamamoto R, Yamamura Y, Lee JB
    • Organizer
      Plant Biology 2020 World Wide Summit
    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 薬用植物スコパリアのBenzoxazinoid生合成における糖転移酵素の解析2020

    • Author(s)
      笠井優理亜, 倉岡孝好, 吾郷良輔, 李 貞範, 山村良美
    • Organizer
      第61回日本植物生理学会年会
    • Related Report
      2019 Research-status Report
  • [Presentation] 薬用植物スコパリア由来のテルペン合成酵素遺伝子群のin vivoにおける機能解析2019

    • Author(s)
      石田和也, 山本 涼, 山村良美, 黒崎文也, 李 貞範
    • Organizer
      第60回日本植物生理学会年会
    • Related Report
      2018 Research-status Report

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Published: 2018-04-23   Modified: 2021-12-27  

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