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Elucidation of inhibitory mechanism of binding of long noncoding RNA via arginine methylation and its physiological significance

Research Project

Project/Area Number 18K06939
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Allocation TypeMulti-year Fund
Section一般
Review Section Basic Section 48040:Medical biochemistry-related
Research InstitutionSaitama Medical University

Principal Investigator

黒川 理樹  埼玉医科大学, 医学部, 教授 (70170107)

Project Period (FY) 2018-04-01 – 2022-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2020)
Budget Amount *help
¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2018: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Keywordsアルギニンメチル化 / RNA結合タンパク質 / TLS / FUS / lncRNA / pncRNA-D / RNA結合たんぱく質 / arginine / methylation / long noncoding RNA / histone acetylation
Outline of Annual Research Achievements

2020年度は、TLS・FUSに結合する新規lncRNAの同定を行った。現在までに、TLSは、相分離研究のモデル系として生化学・分子生物学・構造生物学研究に用いられ、多くのNature, Cell, Science論文が発表されてきた。TLSの構造と機能には、RNA結合が重要な役割を果たしている。また、TLSのRNA結合が相分離の制御にも関与することが示唆されている。したがって、TLSに結合する新規RNAの同定は、相分離研究を推進するものである。しかしながら、TLSに結合するRNAは、私どものpncRNA-D以外、あまり報告されていない。そこで本研究では、pncRNA-Dと同じカテゴリーのlncRNAで、TLSに結合するRNAを探索した。
まず、大腸菌発現GST-TLSをライゼートからGSTアガロースにより分離・精製し、MNaseヌクレアーゼによりGST-TLSに結合した大腸菌の内因性のRNAを除去した。このGST-TLSとHeLa細胞の総RNAをインキュベーションした。このHeLa細胞RNAを結合したGST-TLSをRNeasy Plus Mini kit(Qiagen)で処理して、結合したRNAを分離した。これをヒトlncRNAマイクロアレイ(SurePrint G3 , Agilent)で解析し、結合したRNAシグナルを検出した。
この結果、対照のHeLa細胞RNAに比べて、GST-TLS結合画分で10倍以上シグナルが増加したlncRNAは51種類が見出された。20倍以上のシグナル増加が見られたlncRNAも11種類が検出された。現在、アノテーションのある上位11種類のlncRNAについて結合実験を行っている。この過程で、すでに複数のTLS結合性の新規lncRNAが同定された。これはTLS研究に有為な貢献なす成果である。この成果を論文発表したいと考えている。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

実験計画で予定された項目は、9割以上完遂した。したがって、おおむね順調に進展していると認められた。

Strategy for Future Research Activity

2020年度は、TLSに結合する新規lncRNAを同定した。このlncRNAから、メチル化によりTLS結合が抑制されるlncRNAを同定する。大腸菌発現のGST-TLSをアルギニンメチル化酵素PRMT1でメチル化し、非メチル化GST-TLSを陰性対照として、GST-TLSメチル化の新規に同定されたlncRNAのTLS結合に対する効果を調べる。pncRNA-Dと同様にメチル化依存的にTLS結合が抑制されるlncRNAの同定は、本研究の大きな成果となる。
そして、当該lncRNAがヒストンアセチル化酵素活性(HAT)を抑制するか検討する。すなわち、各lncRNAをHAT活性測定実験系に添加して阻害作用を調べる。
これも大きな成果で、TLSのHATを抑制するlncRNA存在の普遍性を示すことになる。TLSのHAT阻害効果には特異的なRNA結合が必要なので、メチル化により新規lncRNA結合が抑制させると、HAT阻害効果も抑制させる可能性が高い。これを検証していく。そして、同定されたlncRNA群に関して、ノックダウンおよび強制発現実験を行い、TLSのHAT阻害を抑制するか検証する。この成果は、アルギニンメチル化がTLSを介して、lncRNA機能をグローバルに制御する、新しい仕組みを提示する。これは、アルギニンメチル化によるTLSのHAT阻害制御の生物学的意義を検証する成果となる。

Report

(3 results)
  • 2020 Research-status Report
  • 2019 Research-status Report
  • 2018 Research-status Report

Research Products

(9 results)

All 2021 2020 2019 2018

All Journal Article (5 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Peer Reviewed: 5 results,  Open Access: 4 results) Presentation (4 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Invited: 3 results)

  • [Journal Article] Non-coding RNA suppresses FUS aggregation caused by mechanistic shear stress on pipetting in a sequence-dependent manner2021

    • Author(s)
      Nesreen Hamad , Ryoma Yoneda , Masatomo So , Riki Kurokawa , Takashi Nagata , Masato Katahira
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 11 Pages: 9523-9523

    • DOI

      10.1038/s41598-021-89075-w

    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Potential Inhibitor Against Phase Separation, 1,6-hexanediol Specifically Binds to Beta Actin in Nuclear Extract of Human Cell Line2020

    • Author(s)
      Naomi Ueda, Yuki Hirose, Ryoma Yoneda, Toshikazu Bando, Riki Kurokawa
    • Journal Title

      Biomedical Sciences

      Volume: 6 Pages: 88-97

    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Long noncoding RNA pncRNA-D?reduces cyclin D1 gene expression and arrests cell cycle through RNA m6A modification2020

    • Author(s)
      Yoneda Ryoma、Ueda Naomi、Uranishi Kousuke、Hirasaki Masataka、Kurokawa Riki
    • Journal Title

      J Biol Chem.

      Volume: 295 Pages: 5626-5639

    • DOI

      10.1074/jbc.ra119.011556

    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Arginine methylation of translocated in liposarcoma (TLS) inhibits its binding to long noncoding RNA, abrogating TLS-mediated repression of CBP/p300 activity2018

    • Author(s)
      Cui Wei、Yoneda Ryoma、Ueda Naomi、Kurokawa Riki
    • Journal Title

      Journal of Biological Chemistry

      Volume: 293 Pages: 10937-10948

    • DOI

      10.1074/jbc.ra117.000598

    • Related Report
      2018 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Affinity Profiles Categorize RNA-Binding Proteins into Distinctive Groups.2018

    • Author(s)
      Naomi Ueda、Riki Kurokawa
    • Journal Title

      Biomedical Sciences

      Volume: 4 Pages: 24-31

    • Related Report
      2018 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] 相分離・凝集体形成の抑制因子1,6-hexanediolの作用機構と生理的意義の解明2020

    • Author(s)
      黒川 理樹
    • Organizer
      第43回日本分子生物学会年会
    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 多機能分子FUS/TLS-脂肪肉腫の融合遺伝子、家族性ALSの原因遺伝子、そして、相分離の中心分子としての役割2019

    • Author(s)
      黒川 理樹
    • Organizer
      第42回日本分子生物学会年会
    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Invited
  • [Presentation] Arginine methylation of RNA binding protein TLS inhibits binding to long noncoding RNA, repressing the histone acetyltransferase activity.2019

    • Author(s)
      黒川 理樹
    • Organizer
      Keystone Symposia
    • Related Report
      2018 Research-status Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Arginine methylation of RNA binding protein TLS inhibits binding to long noncoding RNA, repressing the histone acetyltransferase activity アルギニンメチル化によるRNA結合タンパク質TLS機能の制御機構2018

    • Author(s)
      黒川 理樹
    • Organizer
      第41回日本分子生物学会年会
    • Related Report
      2018 Research-status Report
    • Invited

URL: 

Published: 2018-04-23   Modified: 2021-12-27  

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