亜鉛欠乏症への亜鉛要求性タンパク質恒常性維持シグナル伝達機構破綻の関与

Research Project

Project/Area Number	18K06957
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 49010:Pathological biochemistry-related
Research Institution	Kobe University
Principal Investigator	枝松裕紀神戸大学, 医学研究科, 講師 (70335438)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2018)
Budget Amount *help	¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000) Fiscal Year 2020: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2019: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2018: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Keywords	ras / がん / 細胞死 / 亜鉛 / タンパク質恒常性 / トランスクリプトーム / 小胞体ストレス / シグナル伝達 / 亜鉛生物学 / 細胞内シグナル伝達 / マーカー遺伝子
Outline of Annual Research Achievements	活性型変異体Rasの発現が引き起こす細胞死とその亜鉛による抑制の仕組みを解明する目的で、マイクロアレイを用いたトランスクリプトーム解析を行った。培地への亜鉛添加無しでの活性型Rasの発現の有無、および亜鉛添加有りでの活性型Rasの発現の有無の合計4条件に置かれた細胞で解析した。その結果、活性型Ras発現下では、トランスクリプトームが亜鉛の添加の有無により顕著に変化することが分かった。次に、活性型Rasと亜鉛添加により上方制御される遺伝子群について、ジーンオントロジー解析を行った。その結果、亜鉛非添加時の活性型Rasの発現では、小胞体（ER）ストレス応答やそれによる細胞死（アポトーシス）誘導に関連した複数のGOタームのエンリッチメントが上位に認められた。亜鉛添加時の活性型Rasの発現でも、ERストレス応答に関連したGOタームのエンリッチメントは認められたが、亜鉛非添加時と比べてその傾向は弱かった。以上から、活性型変異体によるRasシグナル伝達系の恒常的活性化はERストレスにつながり、亜鉛存在下ではそのERストレスが緩和されやすいことが示唆された。研究開始時には、ERストレスの緩和に関わる遺伝子が亜鉛存在下特異的に活性型Rasによって活性化されると予想していた。しかし予想に反して、該当する機能を持ち得る遺伝子の有意な発現誘導は認められなかった。さらに、ATF6の支配下にある遺伝子の発現上昇への亜鉛添加による促進も、当初の期待ほどには認められなかった。これらから、活性型RasによるERストレスでは、その緩和に関わる遺伝子が亜鉛依存的に活性化されるというより、むしろ活性型Rasが発現誘導する分子が亜鉛依存的に機能発揮すると考えられた。この考えに基づいて、再度、活性型Rasが発現誘導する遺伝子をマイクロアレイのデータから探索し、この過程に関わる複数の候補分子を挙げることができた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason マイクロアレイ法によるトランスクリプトーム解析を行った結果、「ATF6軸の活性化が亜鉛依存的である」という研究開始時の仮説に否定的なデータが示された。しかし、研究開始前の仮説がオミックス解析によらない限局的な予備実験データに基づいたものであったことを考えると、本研究で実施したトランスクリプトーム解析とオントロジー解析は研究開始前に不明であった「活性型変異体Rasによる細胞死の亜鉛による抑制の仕組み」の全体像を明確に捉えることに成功したと言える。さらに、このトランスクリプトーム解析の結果に基づいて新たに検証可能な仮説が準備できたので、おおむね順調に進捗していると評価できると考えている。
Strategy for Future Research Activity	活性型Rasによって発現誘導されかつ亜鉛依存的にERストレスの緩和過程で機能する分子の候補として挙げられたタンパク質の機能と役割について、詳細な検討を進める。具体的には、当該遺伝子に対するsiRNAを用いた遺伝子ノックダウンや阻害剤を用いた実験により解析する。当初計画では、研究2年目は活性型Ras発現に依存しない実験系（例えば、血球細胞やムチン産生細胞）での解析を行う予定でいたが、ras変異がんと亜鉛依存性のERストレス緩和との関連性の有無を明らかにするための研究をまず行って、Ras経路の活性化によるERストレス緩和への亜鉛の役割について解明することを優先させることにした。そのため、当初の計画の後半での実施を予定していたras変異がん細胞株を研究材料に用いた研究を先に進める。同時に当該遺伝子産物の発現とRas経路関連遺伝子の変異との関連について、各種データベースを用いた検討で明らかにしていきたいと考えている。