バイオフィルム離脱細菌の解析と治療への応用

Research Project

Project/Area Number	18K07122
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 49050:Bacteriology-related
Research Institution	Jikei University School of Medicine
Principal Investigator	田嶌亜紀子東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (70317973)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2018)
Budget Amount *help	¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000) Fiscal Year 2020: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2019: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000) Fiscal Year 2018: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Keywords	バイオフィルム離脱 / PNAG / 病原性 / 黄色ブドウ球菌
Outline of Annual Research Achievements	我々はバイオフィルムから離脱した黄色ブドウ球菌（離脱細菌）は、好中球による貪食に抵抗性を示すことから高い病原性を保持している可能性を見出した。バイオフィルム内で抗菌剤や宿主の攻撃から逃れていた菌は、遊離後も宿主の防御機構を回避し感染の拡大を引き起こす可能性が考えられるため、バイオフィルムから離脱した菌がどのような性状をもち、病原性を発揮するのかを解析した。バイオフィルム形成前の浮遊細菌に対し、バイオフィルムから離脱した菌では、好中球との共培養3時間後においても、高い生存率を示した。離脱細菌では、菌体表面の細胞外多糖poly-N-acetylglucosamine (PNAG)の発現が高く、PNAG分解酵素Dispersin B処理により好中球に貪食・殺菌されやすくなったことからPNAGの発現が貪食抵抗性の原因であると考えられた。LDHアッセイによる細胞傷害性試験やH2O2殺菌作用に対する感受性に差はみられなかった。RT-PCR, レクチンブロット法によりPNAG発現解析を行ったところ、細菌はバイオフィルム内で時間とともに発現を増加させており、離脱細菌は菌体表面にPNAGを多く保持したまま遊離してくると考えられた。また離脱細菌は、付着力が強く血清コート・非コート下でのポリスチレン付着能やバイオフィルム形成能が高かった。マウス感染モデルにおいて、バイオフィルム離脱細菌の投与群では、血中菌数、臓器内菌数が高い傾向にあり、マウス生存率は50%に低下したが、浮遊細菌やPNAG欠失変異株の投与群では、マウスの死亡はみられなかった以上より、細菌はバイオフィルムの構造体の中で守られているだけでなく、そこから遊離すると、好中球による貪食を回避し、感染の拡大・悪化を引き起こす可能性が示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason バイオフィルム離脱細菌の性状を明らかにするため、以下の項目について解析を行った。 ①好中球貪食抵抗性の解析については、菌体表面に多糖PNAGを多く発現することによって好中球による貪食抵抗性を示すことが明らかとなった。②in vitro病原性解析については、好中球に対する細胞傷害性やH2O2による殺菌作用に差は見られなかったが、付着力が高いことが明らかとなった。PNAGは抗菌ペプチドによる殺菌抵抗性に寄与すると報告されていることから、今後解析を行っていく。③in vivo病原性の解析については、マウス感染モデルにおいて高い病原性を有することを明らかにした。④網羅的発現解析については、二次元電気泳動解析について予備検討を行っており、今後さらに解析を行っていく。以上より、概ね計画通り実験は進行していると判断した。
Strategy for Future Research Activity	マウス感染実験においてバイオフィルム離脱細菌は、高い病原性を発揮したことから、今後は、離脱細菌に対する治療法の検討を行っていく。バイオフィルム内の細菌は抗菌剤に抵抗性があることが報告されているが、離脱細菌では不明であるため各種の抗菌剤を用いて、その有効性（殺菌濃度、時間）を解析する。また二次元電気泳動などの網羅的発現解析をさらに進め、離脱細菌で特徴的な発現因子から殺菌のための標的（代謝やストレス関連因子など）を見出し、それらに対して有効な物質を既知の報告などから探索し、in vitroで有効性を検討する。また離脱細菌で発現が見られる表面抗原などを標的とした抗体療法の可能性についても検討を行う。