結核菌タンパク質PE_PGRS30のPHB2を介したアポトーシス誘導機構の解析
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18K07134
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 49050:Bacteriology-related
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| Research Institution | National Center for Global Health and Medicine |
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Principal Investigator |
松村 和典 国立研究開発法人国立国際医療研究センター, その他部局等, 研究員 (70537670)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2019)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2020: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2018: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
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| Keywords | 結核菌 / マクロファージ / PE_PGRS30 / PHB2 / アポトーシス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
結核は、今なお対策が必要な感染症であり、結核菌の病原性解明が求められているが、細胞間伝播の機序は不明な点が多い。PE_PGRSファミリーは、結核菌タンパク質の10%を占めるPE/ PPEファミリーのサブファミリーで、特定の機能を有する共通ドメイン等は報告されておらず、機能が同定されているタンパク質も少ない。我々は、結核菌タンパク質PE_PGRS30をマクロファージ様細胞株RAW264.7に発現させると、アポトーシスが誘導されることを見出した。PE_PGRS30は、遺伝子発現やミトコンドリア維持に関与するプロヒビチン２（PHB2）と相互作用していた。PHB2は、核やミトコンドリアに局在し、細胞周期やミトコンドリアの構造・品質維持に関与するタンパク質として知られている。核内では、PHB2は転写因子として機能し、ミトコンドリアでは、PHBと二量体を形成し、ミトコンドリアに局在するGTPaseであるOPA1の長さを長い状態に保つ機能を有する。OPA1が切断されて短くなるとアポトーシスが誘導される。大腸菌に、PE_PGRS30のPGRS領域だけ（PGRS30）を発現させ、精製したPGRS30をマクロファージ添加したところ、PGRS30は細胞質内でPHB2と共局在した。さらに、細胞質内PHB2量が微増するのに対し、核内PHB2量が減少し、OPA1の長さが短くなる傾向を見出した。このことから、PGRS30は、PHB2と結合して細胞質に留め、その機能を阻害する可能性が示唆された。また、PE_PGRS30のＣ末端から100アミノ酸分の抗原ペプチドを大腸菌で発現、精製し、ウサギに免疫することでPE_PGRS30特異的抗体を回収し、結核菌培養上清中にPE_PGRS30が存在することを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまで、結核菌タンパク質PE_PGRS30が細胞死を誘導する可能性が示唆されていたが、詳細は明らかにされていなかった。現在まで、本研究では、PE_PGRS30の誘導する細胞死はアポトーシスであること、PE_PGRS30がマクロファージ内で標的とする因子が、PHB2であること、マクロファージ内及び試験管内でも、PE_PGRS30とPHB2が結合し、また、それぞれの相互作用領域を示唆する結果を得た。本年度は、さらにPE_PGRS30のPGRS領域を組換えタンパク質で作製し、マクロファージに添加することで、PHB2の核から細胞質への移動がみられ、かつ、OPA1の長さが短くなることも確認でき、より詳細な機構を明らかにしつつある。また、PE_PGRS30に特異的な抗体を作製することで、PE_PGRS30が結核菌培養上清中にも存在することを示すことができ、分泌されている可能性も考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
・p53の活性測定 PE_PGRS30をマクロファージに発現させて、p53活性化依存的に発現上昇するp21やBaxの発現をウェスタンブロットやqPCRで確認し、PE_OGRS30の発現によりp53が活性化するか明らかにする。
・結核菌感染細胞のアポトーシス誘導 PE_PGRS30欠損結核菌をマクロファージに感染させ、野生株と比較してアポトーシス誘導が減少するか検討し、PE_PGRS30が結核菌感染マクロファージのアポトーシスを誘導することを明らかにする。また、PHB2ノックダウンマクロファージに結核菌を感染させアポトーシス誘導が減少するか検討し、PHB2が結核菌感染マクロファージのアポトーシスに寄与していることを明らかにする。
・結核菌から分泌されたPE_PGRS30の感染細胞内局在 PE_PGRS30は、結核菌から分泌されることが確認できている。結核菌をマクロファージに感染させて免疫染色によりPE_PGRS30の検出を試み、分泌されたPE_PGRS30の感染細胞内局在を明らかにする。PHB2と共局在しているかどうか、PHB2が核またはミトコンドリアに局在するかどうかも検討し、PE_PGRS30を発現させた結果と整合性がとれるか確認する。
・PE_PGRS30の結核菌病原性への寄与及びPHB2の宿主抗結核免疫への寄与：PE_PGRS30欠損結核菌のマウス感染実験（生死観察、肺の生菌数測定）により、PE_PGRS30の結核菌病原性への寄与を明らかにする。また、肺の組織染色からPE_PGRS30のアポトーシス誘導への寄与を明らかにする。さらに、PHB2ノックアウトマウスは胎生致死のため、PHB2コンディショナルノックアウトマウスを作出し、結核菌感染実験（生死、肺の生菌数測定、肺切片組織染色）により、PHB2の宿主抗結核免疫への寄与を明らかにする。
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Report
(2 results)
Research Products
(3 results)
