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iPS細胞由来の再生T細胞と遺伝子改変サルを用いたがん免疫細胞療法の開発

Research Project

Project/Area Number 18K07171
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Allocation TypeMulti-year Fund
Section一般
Review Section Basic Section 49070:Immunology-related
Research InstitutionShiga University of Medical Science

Principal Investigator

縣 保年  滋賀医科大学, 医学部, 教授 (60263141)

Project Period (FY) 2018-04-01 – 2021-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2019)
Budget Amount *help
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2018: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Keywordsゲノム編集 / CRISPR/Cas9 / カセット交換法 / RMCE / がん抗原 / T細胞受容体(TCR) / iPS細胞 / カニクイザル / カセット交換法 RMCE / がんモデル動物 / キラーT細胞 / T細胞受容体
Outline of Annual Research Achievements

本研究では、がん抗原特異的なT細胞受容体(TCR)遺伝子を、ゲノム編集とカセット交換法を用いて、ヒトiPS細胞の内在性TCR遺伝子座へノックインすることを目的とした。まず実験系を確立するために、ヒトT細胞白血病株Jurkat細胞を用いて実験を行い、導入したTCRを正しく発現させることに成功した。そこでiPS細胞でも同様に実験を行い、カセット交換法でTCR遺伝子をノックインすることができたため、T細胞へ分化誘導したところがん抗原特異的に細胞傷害活性を示すことが確認できた。
さらにカニクイザルのがんモデルを作出するため、優性変異型p53CT、CDK4、活性化型KRAS(G12V)、テロメラーゼ逆転写酵素TERTの4つのがん関連遺伝子をドキシサイクリン誘導性に発現するトランスジェニック(Tg)サルの作製を行い、2頭が出産した。他のTgサルと比較して妊娠効率が低いことから、レンチウイルスベクターを改良し、改良ウイルスを用いてTgサルの作製を行い、さらに2頭が出産した。このうち1頭の胎盤において、遺伝子導入のマーカーであるGFPとクサビラオレンジの蛍光が確認され、4つのがん関連遺伝子がゲノムDNAに挿入された産仔を得ることができた。
併行してMHCホモサル由来の腫瘍細胞をMHCヘテロサルに移植し、腫瘍組織に浸潤したT細胞や、腫瘍細胞を繰り返し移植することで迅速に腫瘍細胞を拒絶するMHCヘテロサルの末梢血中T細胞からシングルセルレベルでTCRα鎖とβ鎖の遺伝子をセットで単離した。その中から出現頻度の高いTCR遺伝子セットを選択し、再生T細胞に遺伝子導入したところ、腫瘍細胞を殺傷できるTCR遺伝子を同定することに成功した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究では、がん抗原特異的なTCR遺伝子を、ゲノム編集とカセット交換法を用いて、内在性TCR遺伝子座へノックインするために、まずJurkat細胞を用いて実験を行い、導入したTCRを正しく発現させることに成功した。そこでiPS細胞でも同様に実験を行ったが、薬剤耐性遺伝子カセットのノックインはできたが、カセット交換ができなかった。カセット交換が起きるとPuromycin耐性遺伝子がPGKプロモーターにより発現するが、そのプロモーター活性がiPS細胞では低い可能性が考えられた。そこでPGKプロモーターを、iPS細胞で活性が高いことが知られているEF-1αプロモーターと交換したところ、再現性よくカセット交換ができるようになった。この原因解明と方法改善のために時間を要した結果、研究の遂行に遅れが生じている。
さらに4つのがん関連遺伝子をドキシサイクリン誘導性に発現するトランスジェニック(Tg)カニクイザルの作製を行い、2頭が出産した。他のTgサルと比較して妊娠効率が低いことから、レンチウイルスベクターを改良し、改良ウイルスを用いてTgサルの作製を行い、さらに2頭が出産した。このうち4つのがん関連遺伝子がゲノムDNAに挿入された産仔を1頭得ることができたものの、通常得られるよりも産仔数が少なく、機能解析に充分な産仔が得られるまでにはまだ時間がかかると予想される。
併行してMHCホモサル由来の腫瘍細胞をMHCヘテロサルに移植し、腫瘍組織に浸潤したT細胞などからTCR遺伝子を単離し、レパートリー解析を行い、高い出現頻度を示すTCR遺伝子を同定することができた。これらのTCR遺伝子をT細胞へ導入する実験を試みたが、効率よく遺伝子を導入することが困難であり、方法の改善をはかるのに時間がかかったため、やや研究に遅れが生じている。

Strategy for Future Research Activity

1)iPS細胞でも薬剤耐性遺伝子のプロモーター交換により、再現性よくカセット交換ができるようになり、TCR遺伝子を内在性TCR遺伝子座へノックインすることができたため、T細胞へ分化誘導したところがん抗原特異的に細胞傷害活性を示すことが確認できた。そこでTCR遺伝子をノックインした再生T細胞が、生体内でも抗腫瘍活性を示すか確認する。具体的には、免疫不全マウスに腫瘍細胞を移植したのち、再生T細胞を移入し腫瘍の成長が抑えられるか、さらにマウスの延命や治療効果が見られるか解析を行う。
2)カニクイザルのがんモデル作製では、これまでに計4頭の産仔が得られ、このうち1頭で4つのがん関連遺伝子がゲノムDNAに挿入された産仔を得ることができた。引き続き充分な産仔数が得られるまで作製を続けるとともに、産出されたサルには適切な時期(1歳半から2歳頃を予定)にプログラムポンプを埋込み、ドキシサイクリンの投与により腫瘍が発症するか検討を開始する。腫瘍発生には時間がかかると予想されることから、ポンプを埋め込む前から生検した皮膚組織等を培養し、ドキシサイクリンにより腫瘍化しないか検討する。
3)MHCホモ腫瘍細胞のMHCヘテロサルへの移植実験で、腫瘍組織に浸潤したT細胞で高い出現頻度を示すTCR遺伝子セットを再生T細胞に導入したところ、腫瘍細胞を殺傷できるTCR遺伝子を同定することができた。そこでTCR遺伝子を導入した再生T細胞が、生体内でも抗腫瘍活性を示すか確認する。具体的には、1と同様に免疫不全マウスに腫瘍細胞を移植したのち、再生T細胞を移入し腫瘍の成長が抑えられるか、さらにマウスの延命や治療効果が見られるか解析を行う。

Report

(2 results)
  • 2019 Research-status Report
  • 2018 Research-status Report

Research Products

(10 results)

All 2020 2019 2018 Other

All Journal Article (3 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Peer Reviewed: 3 results,  Open Access: 2 results) Presentation (5 results) (of which Invited: 2 results) Remarks (1 results) Patent(Industrial Property Rights) (1 results)

  • [Journal Article] Cytotoxic T Lymphocytes Regenerated from iPS Cells Have Therapeutic Efficacy in a Patient-Derived Xenograft Solid Tumor Model.2020

    • Author(s)
      Soki Kashima, Takuya Maeda, Kyoko Masuda, Seiji Nagano, Takamitsu Inoue, Masashi Takeda, Yuka Kono, Takashi Kobayashi, Shigeyoshi Saito, Takahiro Higuchi, Hiroshi Ichise, Yuka Kobayashi, Keiko Iwaisako, Koji Terada, Yasutoshi Agata, Kazuyuki Numakura, Mitsuru Saito, Shintaro Narita, Masaki Yasukawa, Osamu Ogawa, Tomonori Habuchi, Hiroshi Kawamoto
    • Journal Title

      iScience

      Volume: 23 Issue: 4 Pages: 100998-100998

    • DOI

      10.1016/j.isci.2020.100998

    • NAID

      120006826710

    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Long non-coding RNA MANCR is a target of BET bromodomain protein BRD4 and plays a critical role in cellular migration and invasion abilities of prostate cancer.2020

    • Author(s)
      Nagasawa M, Tomimatsu K, Terada K, Kondo K, Miyazaki K, Miyazaki M, Motooka D, Okuzaki D, Yoshida T, Kageyama S, Kawamoto H, Kawauchi A, Agata Y.
    • Journal Title

      Biochemical and Biophysical Research Communications

      Volume: 526 Pages: 128-134

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2020.03.043

    • NAID

      120006839258

    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Three-step transcriptional priming that drives the commitment of multipotent progenitors toward B cells2018

    • Author(s)
      Miyai Tomohiro、Takano Junichiro、Endo Takaho A.、Kawakami Eiryo、Agata Yasutoshi、Motomura Yasutaka、Kubo Masato、Kashima Yukie、Suzuki Yutaka、Kawamoto Hiroshi、Ikawa Tomokatsu
    • Journal Title

      Genes Dev

      Volume: 32 Pages: 112-126

    • DOI

      10.1101/gad.309575.117

    • Related Report
      2018 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Presentation] Generation of CTLs from iPSCs transduced with TCR genes: development of “TCR cassette” method.2019

    • Author(s)
      永野誠治、寺田晃士、近藤遼平、縣 保年、増田喬子、河本 宏.
    • Organizer
      第48回 日本免疫学会総会
    • Related Report
      2019 Research-status Report
  • [Presentation] Development of an efficient method to introduce TCR genes into the endogenous TCR locus by genome editing and cassette exchange.2019

    • Author(s)
      寺田晃士、近藤遼平、永野誠治、増田喬子、河本 宏、縣 保年.
    • Organizer
      第48回 日本免疫学会総会
    • Related Report
      2019 Research-status Report
  • [Presentation] iPS 細胞から再生した T 細胞とカニクイザルを用いたがん免疫療法の開発.2019

    • Author(s)
      縣 保年
    • Organizer
      令和元年度「5大学連携医療フォーラム」
    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Invited
  • [Presentation] PD-1研究における「点と点」~iPS細胞を用いたがん特異的T細胞の再生.2019

    • Author(s)
      縣 保年
    • Organizer
      第26回大阪母子医療センターシンポジウム
    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Invited
  • [Presentation] がん抗原特異的なTCR遺伝子を内在性TCR遺伝子座へ効率よく導入する方法の確立2018

    • Author(s)
      寺田晃士、近藤遼平、永野誠治、増田喬子、河本 宏、縣 保年
    • Organizer
      第41回日本分子生物学会(2018年11月28日, 横浜)
    • Related Report
      2018 Research-status Report
  • [Remarks] 滋賀医科大学 生化学・分子生物学講座 分子生理化学部門 研究成果

    • URL

      http://www.shiga-med.ac.jp/~hqbioch1/public_html/publish.html

    • Related Report
      2019 Research-status Report 2018 Research-status Report
  • [Patent(Industrial Property Rights)] 外来抗原レセプター遺伝子導入細胞の製造方法2018

    • Inventor(s)
      河本 宏、永野誠治、増田喬子、縣 保年、寺田晃士
    • Industrial Property Rights Holder
      河本 宏、永野誠治、増田喬子、縣 保年、寺田晃士
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Filing Date
      2018
    • Related Report
      2018 Research-status Report

URL: 

Published: 2018-04-23   Modified: 2021-12-27  

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