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RNAタグ法を用いたsmallRNAとRNA結合蛋白の分離法の開発

Research Project

Project/Area Number 19657043
Research Category

Grant-in-Aid for Exploratory Research

Allocation TypeSingle-year Grants
Research Field Functional biochemistry
Research InstitutionNational Institute of Infectious Diseases

Principal Investigator

三戸部 治郎  National Institute of Infectious Diseases, 細菌第一部, 主任研究官 (40333364)

Project Period (FY) 2007
Project Status Completed (Fiscal Year 2007)
Budget Amount *help
¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2007: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
KeywordsRNA / クロスリンク / 赤痢菌 / 転写後調節
Research Abstract

モデルケースとして、当研究部門で解析中の、温度により発現が転写後制御される、赤痢菌の病原性プラスミド上の制御因子invE遺伝子の5'-non coding regionにboxB配列を導入した。この1コピーのboxB配列がinvEの発現制御に影響しないことを確認した後、InvE蛋白が転写後調節で抑制される30℃で培養し培養液にフォルマリンを終濃度1%に加えることで、タグの付加されたinvE-mRNAとその結合蛋白Hfqならびに未知の調節RNA分子クロスリンクさせた。この細胞抽出液にタグ配列に特異的に結合するビオチン付加λNペプチドを作用させ、目的とするRNA複合体をストレプトアビジン磁気ビーズで精製した。得られた複合体は70℃の熱処理で、クロスリンクによる共有結合を可逆的に外し、プロテアーゼKで処理して得られたsRNAをポリA化し、オリゴdTプライマーを用いてcDNAを合成し、pGEM-Tベクターにクローニングし、シーケンスを行った。
多数シーケンスした結果、残念ながら全て16S並びに23Sリボゾームの断片配列が得られ、その理由として、機能的にリボゾームが結合した時点で翻訳が中断しているか、λNペプチドの認識する配列が甘いため、細胞内に多量に存在するリボゾームを非特異的に結合してしまう可能性が示唆された。後者の可能性を否定するため、染色体上のRNA結合蛋白Hfqにヒスチジンタグを付加し、フォルマリン処理後、Ni-NTAビーズでRNA-Hfq複合体を精製した後、λNペプチドで再抽出する系を作製し、解析中である。副次的ながらこの系を用いて、Hfqがin vivoでinvE-mRNAに結合していることを証明することが出来た。当初計画された、大腸菌の既知のmRNA-sRNAペアである鉄結合蛋白のsodB-mRNAに関しては上記理由から、invEの系で良好な結果が得られた場合に追試することとした。

Report

(1 results)
  • 2007 Annual Research Report
  • Research Products

    (6 results)

All 2008 2007

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (2 results) Book (2 results)

  • [Journal Article] Involvement of RNA binding protein hfq in the post-transcriptional regulation of invE gene expression in Shigella sonnei.2008

    • Author(s)
      Mitobe J., Morita-Ishihara T., Ishihama A., Watanabe H.
    • Journal Title

      Journal of Biological Chemistry 283

      Pages: 5738-5747

    • Related Report
      2007 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Molecular Characterization of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Isolates Dispersed across Japan by Pulsed-Field Gel Electrophoresis and Multiple-Locus Variable-Number Tandem Repeat Analysis.2008

    • Author(s)
      Pei Y., Terajima J., Saito Y., Suzuki R., Takai N., Izumiya H., Morita-Ishihara T., Ohnishi M., Miura M., Iyoda S., Mitobe J., Wang B., Watanabe H.
    • Journal Title

      Japanese Journal of Infectious Diseases 61

      Pages: 58-64

    • Related Report
      2007 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 赤痢菌のType III secretion systemのPost-transcriptionalな温度、浸透圧制御2008

    • Author(s)
      Mitobe J, Morita-Ishihara T, Ishihama A., Watanabe H.
    • Organizer
      第81回日本細菌学会総会
    • Place of Presentation
      京都国際会議場
    • Related Report
      2007 Annual Research Report
  • [Presentation] Involvement of RNA binding protein hfq in the post-transcriptional regulation of invE gene expression in Shigella sonnei.2007

    • Author(s)
      Mitobe J, Morita-Ishihara T, Ishihama A., Watanabe H.
    • Organizer
      The 37th US-Japan Medical conference Cholera board.
    • Place of Presentation
      Austin Texas,USA
    • Related Report
      2007 Annual Research Report
  • [Book] 食中毒予防必携第二版2007

    • Author(s)
      三戸部 治郎, 渡辺 治雄, 他
    • Total Pages
      542
    • Publisher
      社団法人日本食品衛生協会
    • Related Report
      2007 Annual Research Report
  • [Book] 最新細菌・カビ・酵母図鑑2007

    • Author(s)
      三戸部 治郎, 他
    • Total Pages
      228
    • Publisher
      技術情報協会
    • Related Report
      2007 Annual Research Report

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Published: 2007-04-01   Modified: 2016-04-21  

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