| Project/Area Number |
19657057
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Exploratory Research
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Cell biology
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
村田 昌之 The University of Tokyo, 大学院・総合文化研究科, 教授 (50212254)
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| Project Period (FY) |
2007 – 2008
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2008)
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| Budget Amount *help |
¥3,500,000 (Direct Cost: ¥3,500,000)
Fiscal Year 2008: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000)
Fiscal Year 2007: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
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| Keywords | 細胞接着 / 可視化 / 膜タンパク質 / セミインタクト細胞 / シグナル伝達 |
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| Research Abstract |
マウス・クローディン(CL3)依存的な細胞-細胞間接着を撹乱するキナーゼ阻害剤を網羅的に可視化スクリーニングした。そのため、上皮系培養細胞・Eph4にクローディン-YFP(CL3-YFP)を恒常的に発現するstable transfectan t (Eph4-CL3-YFP)を樹立した。96wellプレートの各wellに、コンフルエントに培養したEph4-CL3-YFP細胞に対し、10μM及び100μMの二種類の濃度のキナーゼ阻害剤ライブラリー(90種類のキナーゼ阻害剤のライブラリー)を、1時間または3時間、37℃でインキュベーションした後の細胞間接着(網目状の細胞接着像)の様子を観察した。観察にはINCell Analyzer (GEヘルスケア社)を用い、各wellから任意の5点を選択し、画像の取得及び解析に供した(ハイスループット可視化スクリーニング)。又、同時に、CL3-YFPの裏打ちタンパク質・ZO-1(内在性)の様子を間接蛍光抗体法により観察し、CL3-YFPの画像と並び比べることにより真に細胞接着のみが撹乱するキナーゼ阻害剤を抽出することができた。その結果、CL3/ZO-1構造の両構造が撹乱を受けるキナーゼ阻害剤(PKC阻害剤を含む9種類)、CL3構造のみが攪乱するキナーゼ阻害剤(1種類)、ZO-1構造のみが撹乱するキナーゼ阻害剤(5種類)を得た。さらに、これらの阻害剤に対し、キナーゼ阻害剤処理濃度、処理時間などを様々に変化させ、共焦点レーザー顕微鏡を用いて細胞接着部分を詳細に観察・検討した結果、細胞-細胞間接着のみに効果を示し、かつ、細胞-基質間接着に影響を与えないキナーゼ阻害剤として、CL3/ZO-1の両構造共に攪乱する阻害剤2種、CL3構造のみ攪乱するもの1種、ZO-1構造のみ攪乱するもの2種を絞り込むことができた。
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