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プリオン蛋白質のデュアルピンポイント蛍光標識法の確立とその応用に関する研究

Research Project

Project/Area Number 19659116
Research Category

Grant-in-Aid for Exploratory Research

Allocation TypeSingle-year Grants
Research Field Virology
Research InstitutionGifu University

Principal Investigator

武藤 淳二  Gifu University, 人獣感染防御研究センター, 助教 (80432186)

Project Period (FY) 2007 – 2008
Project Status Completed (Fiscal Year 2008)
Budget Amount *help
¥3,300,000 (Direct Cost: ¥3,300,000)
Fiscal Year 2008: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2007: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
Keywordsプリオン / 蛋白質 / 蛍光標識 / 蛍光共鳴エネルギー移動 / FRET / 立体構造解析 / 4塩基コドン法 / 神経変性疾患 / 構造解析
Research Abstract

プリオン病は、脳内に存在するプリオン蛋白質(正常型PrP)の立体構造が異常型へ変化し、異常型PrPが蓄積して発病すると考えられている。しかし、正常型から異常型への構造変換メカニズムや異常型PrPの立体構造など未だに不明な点が多く、プリオン病の克服にはこれらの解明が必要である。
これまで正常型PrPの立体構造は明らかにされているが、異常型PrPは不溶性などの理由から構造が未決定なため、異常型PrPの解析手法として蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)に着目した。この技術を応用するため、今年度は、4塩基コドン法を用いてアミノ酸部位2ヶ所を蛍光標識した二重蛍光標識PrPの作製を試みた。
昨年度の研究結果から、発現後の可溶性を考慮し、プリオン遺伝子の後半部(アミノ酸配列121-231番目)を組み込んだPrP発現プラスミドを用いた。変異導入キットを用いて遺伝子2ヶ所に改変を加え、N末端およびC末端を二重蛍光標識するPrP発現プラスミドを構築した。また、FRETを検出するためにBODIPY 558標識tRNAおよびBODIPY FL標識tRNAを合成した。これらの蛍光標識tRNAと構築したプラスミドを無細胞蛋白質合成系の反応液に添加し、30℃2時間加温して二重蛍光標識PrPの発現を行った。インキュベート後、反応液を用いてSDS-PAGEを行い、蛍光イメージャーによりBODIPY 558およびBODIPY FLで標識されているバンドを検出した。さらに、抗PrP抗体を用いたウェスタンブロット法により、このバンドが目的の二重蛍光標識PrPであることを確認した。現在、精製を行ってFRET解析を試みているところである。
本研究によりPrPの二重蛍光標識法を確立したことから、様々な部位を二重蛍光標識したPrPの作製が可能となり、これらから得られるFRETデータは正常型および異常型PrPの構造解析に有用である。

Report

(2 results)
  • 2008 Annual Research Report
  • 2007 Annual Research Report
  • Research Products

    (4 results)

All 2009 2008 2007

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Presentation (2 results)

  • [Journal Article] Variety of antiprion compounds discovered through an in silico screen based on cellularform prion protein structure : Correlation between antiprion activity and binding affinity2009

    • Author(s)
      Junji Hosokawa-Muto
    • Journal Title

      Antimicrobial Agents and Chemotherapy 53

      Pages: 765-771

    • Related Report
      2008 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 正常型プリオン蛋白質構造安定化への挑戦2007

    • Author(s)
      武藤淳二
    • Journal Title

      臨床獣医 25

      Pages: 10-14

    • Related Report
      2007 Annual Research Report
  • [Presentation] 4塩基コドン法によるピンポイント蛍光標識プリオン蛋白質の作製2008

    • Author(s)
      武藤淳二
    • Organizer
      第56回日本ウイルス学会学術集会
    • Place of Presentation
      岡山コンベンションセンター
    • Year and Date
      2008-10-26
    • Related Report
      2008 Annual Research Report
  • [Presentation] アミノ酸部位をピンポイント蛍光標識したプリオン蛋白質の作製2008

    • Author(s)
      武藤淳二
    • Organizer
      第72回日本生化学会中部支部例会
    • Place of Presentation
      岐阜大学
    • Year and Date
      2008-05-24
    • Related Report
      2008 Annual Research Report

URL: 

Published: 2007-04-01   Modified: 2016-04-21  

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