Research Project
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
HB-EGFを含むEGFファミリーの分子は全て膜結合型で産生され、細胞外ドメインがプロテアーゼによって切断されるシェディングという過程を経て初めて分泌型となるが、この過程は個体発生と腫瘍形成に重要な意味を持つことが示されている。EGFファミリーのシェディングの分子機構については、細胞内カルシウム濃度、PKCの活性化、Rasの活性化、ストレス刺激などが重要な役割を果たしていることが知られている。また、ADAM17/TACEプロテアーゼがEGFファミリーの全てのシェディングに関与していることが分かっている。しかし、種々の細胞外刺激に対応した多様なシグナルの活性化がADAM17によるEGFファミリーのシェディングへと収束する分子機構については不明である。この部分の解明を目標としてHB-EGFのシェディングに至るシグナル経路をsiRNAライブラリーを用いたスクリーニングにより明らかにすることが本研究の目的である。申請者らはsiRNAライブラリーを用いて、HB-EGFシェディングに関与する分子のスクリーニングをする系を確立し、分子の同定を終了しつつある。スクリーニングの概要を以下に述べる。まず、HB-EGFをヒト子宮内膜癌由来HECI細胞に高発現したHECI-H細胞にSBI社のsiRNAレンチウイルスライブラリーを感染させ、様々な遺伝子の機能を欠損した細胞群を構築する。そして、HB-EGFのシェディングを誘導するために、HECI-H細胞にTPA刺激を与える。刺激後、トリプシン処理でHECI-H細胞を浮遊化し、HB-EGFに対する抗体を用いて細胞膜上のHB-EGFを染色する。シェディングが起こっていない細胞は細胞表面にHB-EGFの細胞外ドメインが残存しており、強いシグナルを出すと考えられる。HB-EGFシェディング能を欠いていると思われるこれらの細胞をセルソーターFACSAriaを用いて分取する。分取された細胞からRNAを回収し、siRNA周辺の塩基配列特異的なプライマーを用いて、siRNA配列を含むDNAを増幅する。SBI社のsiRNAライブラリーのsiRNAの配列はアフィメトリックス社のマイクロアレイに対応している。このため、マイクロアレイ解析により分取された細胞群で発現されていたsiRNAが容易に同定できた。また、これらのsiRNA発現ベクターをクローン化し、実際にHB-EGFのエクトドメインシェディングを阻害することも確認できた。さらに、これらのsiRNAがターゲットとする遺伝子に対する別のsiRNA発現ベクターを作製し、このsiRNAもエクトドメインシェディングを阻害することも確認し、HB-EGFのエクトドメインシェディングに関与する新規の遺伝子が同定できた。今後は、この遺伝子がADAM17/TACEプロテアーゼを活性化する分子機構の解明に向けて研究を進めていく予定である。
