微生物の全ゲノム解析を実現する「DNA非切断型」Target-AID技術の拡張

• Project/Area Number: 19J40073
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Review Section: Basic Section 43060:System genome science-related
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 坂野 聡美 大阪大学, 情報科学研究科, 特別研究員(RPD)
• Project Period (FY): 2019-04-25 – 2022-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2020: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2019: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: ゲノム編集 / 合成生物学 / CRISPR / 遺伝子工学 / 大腸菌

Outline of Research at the Start

本研究は、DNAを切らないゲノム編集ツールTarget-AIDの応用を目的とする。塩基置換融合酵素dCas9-PmCDA1と配列認識ユニットCRISPR-gRNAを微生物に導入するだけで、複数の標的DNAの同時編集を簡便かつ高確率に行うようツールを改良し、実用化を目指す。現在、大腸菌の複数DNAへの同時変異導入はある程度可能であるが、その確率は高くない。そこで、効率を上げるためのツールの改良と評価（技術構築）、他の微生物にも適用できるツールの作製（技術拡張）、複数遺伝子操作技術の実証（実用化）の3つの計画を遂行する予定である。

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、DNA を切らずにゲノム編集を行うTarget-AID 技術を、次世代の合成生物学、遺伝子工学を飛躍的に発展させる基盤技術として確立することを目的とする。具体的には、塩基置換融合酵素dCas9-PmCDA1 と配列認識モジュールCRISPR-gRNA を原核生物に導入するだけで、複数の標的DNA の同時編集を簡便かつ高確率に行うツールへと技術拡張し、応用・実用化に向けて研究を進めてきた。現在、大腸菌ゲノムの標的1遺伝子内に、ある程度効率よく変異を導入することが可能となっている。しかしながら、複数の標的DNA への同時塩基置換を、簡便化かつ高効率化することが課題である。
そこで、本課題３年目では、まず、複数遺伝子への同時塩基置換の効率を上げるために、３～６種類の標的部位をもつCRISPR-gRNAプラスミドを同時に大腸菌に導入する際の培養条件検討と同時塩基置換の効率を調べた。様々な方法を試した結果、３～４遺伝子への同時塩基置換を確認することができたが、その置換効率は配列に依存しており、まったく置換されない配列というのもあった。今後は、プラスミドに頼らない遺伝子編集法の構築を検討する必要がある。
次に、技術の拡張に向けて、標的1遺伝子変異導入を用いた、薬剤耐性菌の変異個所探索法の培養条件検討を行った。培養時の薬剤添加とゲノム編集を行うタイミングを試行錯誤した結果、薬剤耐性に関わる既知の遺伝子以外の配列がいくつか同定された。現在その配列情報に関しては解析中である。今後は、培養条件の再検討やスクリーニング法の改良などを行い、Target-AIDを用いた新規遺伝子スクリーニング法の構築を行う予定である。

Research Progress Status

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。