| Project/Area Number |
19K06562
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43030:Functional biochemistry-related
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
Hizukuri Yohei 京都大学, 医生物学研究所, 助教 (70568930)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
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| Keywords | 膜タンパク質 / 膜内切断プロテアーゼ / Rhomboid / べん毛 / III型分泌装置 / 翻訳後修飾 / 品質管理 / 抗体ラベリング / 大腸菌 / 膜内タンパク質分解 / 基質認識機構 / 構造解析 / S2P / 抗体標識 / PAタグ / ジスルフィド架橋 / タンパク質間相互作用 / in vivo光架橋法 / kinetics解析 / FRET / ロンボイド / アシル化 |
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| Outline of Research at the Start |
細菌べん毛III型分泌装置構成因子FliOは予想外に複雑な翻訳後多段階プロセシングを受ける。(A)膜内切断プロテアーゼGlpGによるFliOの「切断」と、(B)FliOの新奇な「N末端アシル化修飾」について、以下の解析からその意義を明らかにする。
■（A）-【1】様々な架橋法を用いたGlpG―基質間の相互作用解析
■（A）-【2】in vitro再構成系でのGlpGによるFliO切断の反応速度論的解析
■（B）-【3】未知の細胞膜外N末端アシル化修飾酵素の探索
■（B）-【4】FliOにおけるN末端アシル化修飾の生理的意義の解明
■（B）-【5】膜タンパク質の膜外N末端アシル化修飾のグローバル解析
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| Outline of Final Research Achievements |
This project aims to elucidate the post-translational multi-step processing, such as cleavages and modifications, observed in the bacterial flagellar type III secretion apparatus-related protein FliO. We analyzed the regulatory mechanism of FliO cleavages mediated by the E. coli intramembrane protease GlpG, and i) clarified common features and differences in substrate recognition mechanisms at the identified two distinct cleavage sites, ii) elucidated interaction residues between GlpG and FliO, and iii) suggested the physiological significance of FliO cleavage. We also developed the antibody labeling technique for target proteins using highly sensitive and high-affinity PA tags and applied them to analyze the kinetics of FliO cleavage and modification reactions. Furthermore, we determined new X-ray crystal structures of other family intramembrane proteases and proposed a model for the substrate accommodation and cleavage mediated by the gate structure.
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| Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements |
膜内切断プロテアーゼはアルツハイマー病やパーキンソン病等の重大な遺伝病の発症や微生物病原性等に深く関わるため、その分子的・酵素学的理解は創薬にもつながる重要な課題である。本研究ではFliOの多段階翻訳後プロセシングの一端であるGlpGによる膜内切断の分子機構を明らかにした。これは膜タンパク質の翻訳後機能調節機構の新たな側面を示すとともに、細菌の病原性発揮にも関わるべん毛構築の制御機構の解明につながり、細菌感染症治療においても意義がある。また、PAタグを用いたタンパク質の抗体ラベリング技術は、タンパク質への非破壊的な抗体結合を可能とし、高収量・高純度のタンパク質精製や構造解析にも応用しうる。
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