Regulation mechanism of apoptosis-inducing death receptor localization allowing for survival in tumor cells
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19K07648
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 50010:Tumor biology-related
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
小島 裕子 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60231312)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2019)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2022: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2019: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
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| Keywords | DR5 localization / TRAIL / TRAIL-resistant tumor / Importin β1 inhibition / Agonistic antibody / Cancer therapy / 局在制御 / アポトーシス / 腫瘍細胞 / 分子標的がん治療 / 細胞内輸送 |
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| Outline of Research at the Start |
TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) は正常細胞を除く腫瘍細胞に細胞死を誘導し，副作用の少ない抗腫瘍効果が期待される分子である．TRAILと細胞表面膜で結合して死のシグナルを伝達するDR5 (Death receptor 5) は，TRAIL耐性ヒト腫瘍細胞では主に核に発現して細胞死を免れ，DR5を核内へ運搬するインポーチン（Imp）beta1の働きを抑えると，腫瘍細胞死が誘導される.では，なぜ腫瘍細胞は自身に細胞死をもたらすタンパク質の局在を変えて生存を獲得できるのか，DR5 の局在を決定する分子を同定して新たながん治療への応用を考える．
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究に関連してTRAIL/DR5耐性ヒト腫瘍細胞株のマウス異種移植モデルを作成、３種の方法でimportin β1を阻害し、in vivoで腫瘍の拒絶を誘導できることを証明した。
1. Doxycycline誘導性にimportin β1の発現をノックダウンする、２種類のHeLa細胞株：#B1、#C14およびコントロール細胞株を作成、RAG-2(-/-)マウスの皮下生着後、 Doxycycline飲水投与と非投与群に分け、各群で抗DR5アゴニスティック抗体：CS-1008またはコントロール抗体：hIgGを腹腔内投与、４群の腫瘍増殖を比較。その結果、Doxycycline投与且つCS-1008投与群で、有意に腫瘍の増殖が抑制、うち#C14腫瘍は完全に拒絶された。
2. RAG-2(-/-)にHeLa細胞株またはHepG2細胞株の皮下生着後、実験１で用いた２種類のimportin β1 ノックダウン配列B、Cおよびコントロール配列を移入したベクタープラスミドDNAを、アテロコラーゲンと共に腫瘍周囲に接種し徐放性にノックダウンを誘導、Doxycycline飲水投与とCS-1008またはhIgGを腹腔内投与し、各群で腫瘍の増殖を比較。その結果、in vivoでimportin β1ノックダウンを誘導した群で、HeLaで腫瘍の増殖抑制が、HepG2で拒絶された。
3. RAG-2(-/-)にHeLaまたはHepG2を皮下生着後、CS-1008またはhIgGとimportin β阻害剤：importazoleまたは溶媒接種を開始。各群で腫瘍の増殖を比較。その結果、HeLaで増殖抑制が、HepG2で拒絶された。
何れの実験でもin vitroでDR5の細胞膜発現が増加しアポトーシスが誘導されることから、TRAIL/DR5耐性ヒト腫瘍の治療にDR5局在コントロールが寄与する可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
投稿準備中の論文を作成して投稿した後、レビューアーに要求されたリバイスの実験を行い、その実験結果を加えて論文修正を行い、論文受理までに時間を要したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
I. タンパク質合成後の核内DR5の運搬ルートの解析
① 細胞表面でTRAILと結合したDR5の動態解析：蛍光標識したリコンビナントTRAILを，DDを欠損した野生型 (WT) DR5-GFP発現腫瘍細胞と，2種のNLS変異型 (NLS-M1, -M2) で且つDD欠損のDR5-GFP発現腫瘍細胞に作用させてレーザー顕微鏡で解析，膜でTRAILと結合したDR5が核内に移行しないかを確認する．② 小胞体 (ER) からゴルジ装置 (Golgi) へのDR5輸送とその局在解析：①の細胞にBrefeldin Aを作用させて，ERからGolgiへのタンパク質輸送を阻害した時のDR5-GFPの局在を解析し，未処理の細胞と比較して変化するかを検討する．
II. hDR5の局在の決定に関与する分子の探索・その分子の発現と機能の相関の解析
① hDR5の局在決定に関与する分子の探索：バーコード化されたヒトshRNAライブラリーを用いてTRAIL抵抗性ヒト腫瘍細胞株に組換えウイルスを感染させ，同時に組み込まれた蛍光タンパク質を指標にして，核内への運搬が抑制されて細胞表面でDR5の発現が増加している細胞集団を集め，それを純化する．バーコードによる次世代ハイスループットシーケンシングを行って解析し，ノックダウンにより細胞表面のDR5の発現が高くなるshRNA標的分子を複数ピックアップする． DR5の発現量を変化させずに，腫瘍細胞のTRAIL感受性を有意に上昇させることが可能な，DR5の局在の決定に働く候補分子を同定する．② 腫瘍細胞における候補分子の発現と機能との相関性の解析：様々なTRAIL感受性及び低感受性腫瘍細胞株において，候補分子の発現量とDR5の局在を調べ，DR5の核内移行との相関を明らかにする．
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Report
(1 results)
Research Products
(2 results)
